双酶法优化禄丰香醋糖化工艺

陈乾睿 赵锐环 徐志强 谷大海

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.05.014

引文格式：陈乾睿，赵锐环，徐志强，等.双酶法优化禄丰香醋糖化工艺[J].中国调味品，2024，49（5）：80-88.

CHEN Q R， ZHAO R H， XU Z Q， et al.Optimization of saccharification process of Lufeng aromatic vinegar by double-enzymatic method[J].China Condiment，2024，49（5）：80-88.

摘要：為提高禄丰香醋的生产效率，通过添加α-淀粉酶与糖化酶，对禄丰香醋生产过程中糖化工艺进行优化。糖化工艺包括液化工艺与糖化工艺两部分：液化实验以还原糖为指标;糖化实验以还原糖为主要指标，黄酮类物质、氨基酸态氮为次要指标。在单因素实验的基础上，采用响应面分析法对禄丰香醋糖化过程中的参数进行优化。研究结果表明，禄丰香醋的最佳糖化工艺参数为α-淀粉酶添加量2.272%、液化pH 4.9、液化温度50 ℃、液化时间43 min，此条件下还原糖含量为5.372 g/100 g。结合实际生产情况，当糖化酶添加量为2.336%、糖化pH为4、糖化温度为55 ℃、糖化时间为60 min、蒸煮时间为1 h、料液比为1∶3时得到还原糖含量为13.614 g/100 g，黄酮含量为6.867 mg/L，氨基酸态氮含量为0.101 724 g/dL。

关键词：禄丰香醋；糖化；工艺优化；双酶法；响应面法

中图分类号：TS264.22      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）05-0080-09

Optimization of Saccharification Process of Lufeng Aromatic

Vinegar by Double-Enzymatic Method

CHEN Qian-rui1，2， ZHAO Rui-huan1，2， XU Zhi-qiang1，2*， GU Da-hai1，2

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，

China; 2.Engineering Technology Research Center for Processing of Livestock Products in

Yunnan Province， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract： To improve the production efficiency of Lufeng aromatic vinegar， α-amylase and glucoamylase are added to optimize the saccharification process during the production of Lufeng aromatic vinegar. The saccharification process includes two parts： liquefaction process and saccharification process. In the liquefaction experiment， reducing sugar is used as the index. In the saccharification experiment， reducing sugar is used as the main index， and flavonoids and amino acid nitrogen are used as the secondary indexes. On the basis of single factor experiment， response surface analysis method is used to optimize the parameters in the saccharification process of Lufeng aromatic vinegar. The results show that the optimal process parameters for saccharification of Lufeng aromatic vinegar are as follows： the addition amount of α-amylase is 2.272%， the liquefaction pH is 4.9， the liquefaction temperature is 50 ℃ and the liquefaction time is 43 min. Under these conditions， the content of reducing sugar is 5.372 g/100 g. According to practical production conditions， when the addition amount of glucoamylase is 2.336%， the saccharification pH is 4， the saccharification temperature is 55 ℃， the saccharification time is 60 min， the cooking time is 1 h and the solid-liquid ratio is 1∶3. the content of reducing sugar is 13.614 g/100 g， the flavonoid  content is 6.867 mg/L， and the amino acid nitrogen content is 0.101 724 g/dL.

Key words： Lufeng aromatic vinegar; saccharification; process optimization; double-enzymatic method; response surface method

收稿日期：2023-11-09

基金項目：云南省许正宏专家工作站，云南省重大专项及重点研发计划（202105AF150062）；科技入滇专项资金（202105AF150062）

作者简介：陈乾睿（1999—），女，硕士，研究方向：食品科学。

*通信作者：徐志强（1974—），男，副教授，博士，研究方向：畜产品品质控制。

醋是中国传统的酸性调味品。中国传统食醋是以粮食为主要原料，经多种微生物共同发酵，再经长时间陈酿而成的酸性液体调味料，在我国已有3 000多年的历史[1]。

禄丰香醋是一种具有云南风味的传统名醋。史书记载，明朝中叶，禄丰当地以糯米为原料，经20余味中药制曲，酿制成醋，将醋吸附在清洁的布帛上，名曰“干醋”，曾作为贡品送进京城。近年来，许坤一等[2]对传统技艺重点进行微生物菌种学和发酵方式的技术改造，形成了一套新的固态生产程序。在不同地区，因为地理环境与气候不同，食醋的酿造工艺与使用的原料具有不同的特点。采用传统工艺，出醋率较低，原材料的利用率较低，成本较高。

生产食醋一般有4个过程：液化、糖化、酒精发酵、醋酸发酵。原料需经糖化酶或糖化菌分解（一般用米曲菌和黑曲菌等）才能成为可被酵母菌利用的糖类，再进一步进行酒精发酵和醋酸发酵，最终转化成醋[3]。

糖化阶段是一个重要的阶段，因为在原料进行加热蒸煮时会导致部分成分损失，以及加热过程中温度变化会影响微生物的生长代谢，会直接影响后续发酵，从而影响产品的品质[4]。

采用糖化酶与α-淀粉酶可以生产出水解糖[5]。现已有制醋工艺直接采用酶、纯种酵母、纯种醋酸菌代替糖化曲法发酵生产食醋[6-8]，这表明用酶来代替传统的糖化曲生产食醋具有可实施性。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

糯米：产自云南省禄丰市；α-淀粉酶（10万U/g）；糖化酶（10万U/g）；柠檬酸；柠檬酸钠、盐酸、硫酸铜、亚甲蓝、乙酸锌、氢氧化钠、冰乙酸、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、葡萄糖标准品（纯度≥99%）、甲醛、酚酞、乙醇、邻苯二甲酸氢钾（基准物质）、亚硝酸钠、氯化铝、芦丁标准品（纯度≥99%）：昆明赛捷生物科技有限公司。

1.2  仪器与设备

DZKW-S-4水浴锅  北京市永光明医疗仪器有限公司；UV-9000S紫外可见分光光度计  上海元析仪器有限公司；SZCL-2型智能数显控温磁力搅拌器  巩义市予华仪器有限责任公司；LC22006368 pH计  上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3  实验方法

1.3.1  工艺流程

原料→浸泡→蒸煮→料液比→调节pH→添加α-淀粉酶→水浴加热→冷却1→调节pH→添加糖化酶→水浴加热→冷却2。

1.3.2  测定方法

1.3.2.1  还原糖的测定

参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准 食品中还原糖的测定》中的方法。

1.3.2.2  黄酮的测定

参照DB34/T 2743—2016《槐米及其制品中总黄酮含量的测定 分光光度法》中的方法。

1.3.2.3  氨基酸态氮的测定

参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的方法。

1.3.3  单因素研究

在液化实验中，以还原糖为指标，在保持研究中工艺条件不变的基础上，取25 g糯米，浸泡8～12 h[9]，料液比为1∶3，α-淀粉酶添加量分别为0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%；pH分别为3，4，5，6，7；液化温度分别为30，40，50，60，70 ℃；液化时间分别为20，30，40，50，60 min。

在糖化实验中，以还原糖为主要指标，氨基酸态氮、黄酮为次要指标，在保持研究中工艺条件不变的基础上，糖化酶添加量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%；pH分别为3，4，5，6，7；糖化温度分别为30，40，50，60，70 ℃；糖化时间分别为30，40，50，60，70 min。

1.3.4  Box-Behnken实验

在单因素实验结果的基础上，确定各因素的范围，在液化实验中选取α-淀粉酶添加量、pH、温度、时间4个影响显著的因素，以还原糖含量为响应值。在糖化实验中选取糖化酶添加量、pH、温度、时间4个影响显著的因素，以还原糖、氨基酸态氮和黄酮含量为响应值。响应面实验设计见表1和表2。

1.3.5  数据处理

采用Design-Expert 10、Origin 2018、Excel软件处理数据。

2  结果与分析

2.1  单因素实验结果

2.1.1  α-淀粉酶添加量、液化pH、液化温度、液化时间的确定

由图1中a可知，其余因素一定时，随着α-淀粉酶添加量的增加，还原糖含量逐渐上升。当α-淀粉酶添加量达到2%时，糖化液中还原糖含量达到最大值，然后随着α-淀粉酶添加量的增加，还原糖含量下降。陈磊等[10]的研究发现，酿醋原料中含有一定量的黄酮类物质，而黄酮类物质可通过疏水作用、氢键或范德华力与α-淀粉酶结合在一起，当黄酮类物质结合到α-淀粉酶的非活性中心部位时，对α-淀粉酶表现出非竞争性抑制。基于此原理，当黄酮含量增加时，对α-淀粉酶的抑制性也会增强，从而使还原糖含量呈现下降或平稳趋势。

由图1中b可知，随着pH在3～7范围内增加，还原糖含量先上升后下降，这是因为在一定的酸碱条件下，α-淀粉酶的活性受到了影响[11-12]。在液化过程中，pH为5时，酶活性最佳。大部分真菌α-淀粉酶在生产中的最适作用温度在 50～55 ℃之间，最适pH一般在5.2～5.6之间[13-14]。所以，在本实验中，pH为5时还原糖含量最高是合理的。

由图1中c可知，随着温度的上升，还原糖含量呈现上升趋势，当温度达到60 ℃时，还原糖含量最高，继续升温，还原糖含量开始下降。从α-淀粉酶的最适作用温度来看，温度一旦超过60 ℃或pH小于5时，酶的活性开始迅速下降，从而导致催化反应速率降低[15-17]。

由图1中d可知，当时间为20～40 min时，还原糖含量的上升速度十分迅速，但时间超过40 min后，还原糖含量呈现下降趋势。由解华东等[18]的研究可知，这是由于淀粉的液化分为两个阶段：第一阶段，α-淀粉酶作用于直链淀粉使其迅速分解；第二阶段，α-淀粉酶作用于支链淀粉产生葡萄糖等，同时促进寡糖分解为葡萄糖，第二阶段的反应速度比第一阶段慢。随着时间的延长，底物浓度的降低也会减缓酶反应的效率。大多数酶促反应都是可逆反应，酶反应速度受底物浓度的影响，也受生成物浓度的影响，生成物浓度升高会抑制酶的活性。随着时间的延长，酶活性降低，所以导致还原糖含量下降。

2.1.2  糖化酶添加量、糖化pH、糖化温度、糖化时间的确定

由图2中a可知，糖化酶添加量影响氨基酸态氮、还原糖、黄酮的含量。随着糖化酶添加量的增加，氨基酸态氮含量先下降后升高，在糖化酶添加量为2%时，氨基酸态氮含量达到最高，随着糖化酶添加量的继续升高，氨基酸态氮含量下降。还原糖含量随着糖化酶添加量的增加而升高，当糖化酶添加量为2.5%时达到最高，随着糖化酶添加量的继续增加，还原糖含量下降。孙洁心等[19]的研究表明，糖化酶添加量低于2.5%时，糖化酶与底物充分反应导致糖化反应受酶添加量的影响较大，当糖化酶添加量大于2.5%时，糖化酶添加量已过量，高浓度底物降低了水的有效浓度和分子的扩散性，从而降低了酶促反应速度。黄酮含量随着糖化酶添加量的增加而增加，当糖化酶添加量为2.5%时，黄酮含量达到最高，随着糖化酶添加量的继续增加，黄酮含量下降，原因是随着糖化酶添加量的增加，逐渐将黄酮水解为异黄酮苷。

由图2中b可知，随着pH的增加，氨基酸态氮含量和还原糖含量均呈现先上升后下降的趋势，黄酮含量呈现先上升后下降再上升的趋势，于pH为5时达到峰值，其原因是pH过高或过低均会抑制酶的活性。pH使酶制剂变性失活的原理主要是能破坏其空间结构[20]，引起酶构象的改变，使酶活力丧失。

由图2中c可知，随着糖化温度的上升，黄酮含量和氨基酸态氮含量均呈现先上升后下降的趋势，于50 ℃时达到峰值，之后随着温度的上升而下降。其原因是温度对酶的影响较大，从而影响了氨基酸态氮含量与黄酮含量。随着温度升高，还原糖含量也呈现先上升后下降的趋势，于60 ℃时达到峰值。其原因主要与温度对酶的影响有关。绝大多数糖化酶的最适酶解温度在40～60 ℃范围内，世界上糖化酶最适反应温度最高为65 ℃[10]。李多川[21]报道过一株嗜热真菌最适温度为70 ℃，最适pH值为5.7，在60 ℃条件下保温24 h后酶活性基本无损失，是目前为止我国发现的热稳定性最高的糖化酶。

由图2中d可知，随着糖化时间的延长，黄酮含量和还原糖含量均呈现先上升后下降的趋势，氨基酸态氮含量呈现先上升后下降再上升的趋势。氨基酸态氮含量于30～40 min急速上升，之后趋于平稳。黄酮含量于40 min时达到峰值，之后下降。还原糖含量于50 min时达到峰值，之后下降。其原因为糖化酶作用的底物浓度逐渐降低，使得还原糖含量增长变缓，这时糖化酶对黄酮进行水解，导致黄酮含量下降。

2.2  响应面实验结果

2.2.1  液化响应面实验结果

以还原糖含量为响应值，采用Box-Behnken实验和响应面分析对实验结果进行处理和分析，见表3。液化工艺方差分析表见表4。

由表4可知，该模型回归关系显著，各因素对还原糖含量的影响大小为α-淀粉酶添加量>液化时间>液化pH>液化温度。

各因素交互作用对还原糖含量的影响结果可以通过响应面图直观地反映出来，其中图像底部的等高线可以反映两因素交互作用的强弱，若是椭圆形则表示交互作用较强，圆形则表示交互作用较弱[22]。

由回归方程拟合得到液化工艺的最优工艺条件为α-淀粉酶添加量2.272%、液化pH 4.922、液化温度50 ℃、液化时间42.837 min，此条件下还原糖含量为5.274 g/100 g。

结合实际生产情况进行重复实验，将工艺条件调整为α-淀粉酶添加量2.272%、pH 4.9、液化温度50 ℃、液化时间43 min，此时还原糖含量为5.372 g/100 g。由此说明该模型的拟合程度良好，得到的液化工艺参数可靠。

2.2.2  糖化响应面实验结果

以还原糖、黄酮与氨基酸态氮含量为响应值，采用Box-Behnken实验和响应面分析对实验结果进行处理和分析，见表5。糖化-还原糖工艺方差分析表见表6。

由回归方程拟合得到的糖化工艺的最优工艺条件为糖化酶添加量2.336%、糖化pH 4.008、糖化溫度55.653 ℃、糖化时间59.851 min，此条件下还原糖含量为13.660 g/100 g，黄酮含量为6.883 42 mg/L，氨基酸态氮含量为0.022 486 4 g/dL。

结合实际生产情况进行重复实验，将工艺条件调整为糖化酶添加量2.336%、糖化pH 4、糖化温度55 ℃、糖化时间60 min，此时还原糖含量为13.614 g/100 g，黄酮含量为6.867 mg/L，氨基酸态氮含量为0.101 724 g/dL。由此说明该模型的拟合程度良好，得到的糖化工艺参数可靠。

3  结论

该实验对禄丰香醋生产过程中糖化工艺进行了优化，添加α-淀粉酶与糖化酶代替原本生产工艺中的大曲。在单因素实验的基础上进行Box-Behnken实验，筛选出α-淀粉酶添加量、液化时间、液化pH、液化温度、糖化酶添加量、糖化时间、糖化温度、糖化pH的显著因素。采用响应面法优化了糖化工艺，得出α-淀粉酶添加量为2.272%、液化pH为4.922、液化温度为50 ℃、液化时间为42.837 min时还原糖含量为5.274 g/100 g。糖化酶添加量为2.336%、糖化pH为4.008、糖化温度为55.653 ℃、糖化时间为59.851 min、蒸煮时间为1 h、料液比为1∶3时还原糖含量为13.660 g/100 g，黄酮含量为6.883 42 mg/L，氨基酸态氮含量为0.022 486 4 g/dL。

在此之前，对于禄丰香醋的研究较少，未发现关于禄丰香醋生产工艺优化的相关研究。本实验采用α-淀粉酶与糖化酶对工艺进行优化，为禄丰香醋后续生产工艺的改进提供了理论基础。

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