美洲大蠊提取物PAS840的乙酰胆碱酯酶活性抑制作用及抗氧化能力观察

管堂飞，杨鑫，洪灿辉，肖培云，张成桂，何正春

大理大学药学院 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000

美洲大蠊为蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，是一种世界公认的卫生害虫。美洲大蠊入药始载于《神农本草经》，现为云南彝族民间常用的传统动物药［1］。美洲大蠊可内外兼用，具有促进伤口愈合、解热、抗炎、镇痛等功效［2］。研究显示，美洲大蠊提取物含有丰富的蛋白质、肽、氨基酸、核苷以及多种类型的有机小分子，具有抗纤维化、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等诸多生物活性［3］。根据“胆碱能损伤假说”，在神经退行性疾病阿尔茨海默病（AD）中，神经递质乙酰胆碱减少是其关键致病因素之一［4］。随着年龄的增长，氧化应激反应增加是导致与年龄相关疾病尤其是神经退行性疾病发生的主要因素，而富含抗氧化剂的饮食和药物在抗衰老过程中发挥重要作用［5］。美洲大蠊提取物PAS840是从美洲大蠊虫体中提取，并经大孔树脂分离纯化后得到的精提物。本课题组前期研究发现，美洲大蠊提取物PAS840可减轻过氧化氢（H2O2）引起的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤，提示其可能对氧化应激相关疾病甚至神经退行性疾病有效［6］。2022年10月—2023年5月，本研究观察了美洲大蠊提取物PAS840对乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的抑制作用及其抗氧化活性，以期为美洲大蠊提取物在神经退行性疾病、氧化应激相关疾病治疗中的应用提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 药品：美洲大蠊提取物PAS840冻干粉提取自大理大学药物化学教研室。主要试剂：AChE、牛血清蛋白（BSA）购自美国索莱宝公司，5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化硫代乙酰胆碱（ATCI）、1%十二烷基硫酸钠（SDS）均购自北京伊诺凯科技有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自上海思域化工科技有限公司，磷酸缓冲盐溶液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.38）购自武汉赛维尔科技有限公司。

1.2 美洲大蠊提取物PAS840对AChE活性的抑制作用观察

1.2.1 体外AChE活性检测模型建立 采用改良的Ellman法进行酶促反应［7-8］。AChE活性检测原理：AChE在一定pH条件下，可催化水解底物ATCI生成产物硫代胆碱，而硫代胆碱可迅速与溶液中的显色剂DTNB反应，生成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸盐，其在412 nm波长处有最大吸收；而当AChE活性被部分抑制时，其水解ATCI的能力下降，生成的黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸盐减少，其在412 nm波长波长处的光密度值降低。参照文献［9］确定AChE的浓度为0.85 U/mL，PAS840浓度为15.625 μg/mL，加入不同浓度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的ATCI作为底物，检测作用0、10、20、30 min时5-巯基-2-硝基苯甲酸盐在412 nm波长处的光密度值。结果显示，随着作用时间的延长和底物ATCI浓度的增加，5-巯基-2-硝基苯甲酸盐在412 nm波长处的光密度值均呈升高趋势，提示该模型可稳定可靠地反映AChE活性，可用于后续实验。见OSID码图1。

1.2.2 最佳酶促反应时间确定 采用光密度—时间曲线。取PBS 150 μL，37 ℃水浴预热5 min，再依次加入0.85 U/mL的AChE 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、15 mmol/L ATCI 20 μL，37 ℃水浴反应不同时间（0、5、10、15、20、25、30 min）。使用酶标仪检测412 nm波长处的光密度值，扣除ATCI因非酶催水解所产生的光密度值，确定酶促反应处于初速度的时间，即为酶促反应时间。结果显示，光密度值随着酶促反应时间的延长而升高，但当反应时间达到20 min后光密度值也未见减小，基于反应时间长短以及参考相关文献［8］，选择最佳酶促反应时间为20 min。见OSID码图2。

1.2.3 最佳AChE酶促反应浓度确定 采用光密度—酶活曲线。取PBS 150 μL，37 ℃水浴预热5 min，依次加入不同浓度（0.106 25、0.212 5、0.425、0.850、1.700 U/mL）的AChE 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、15 mmol/L ATCI 20 μL，37 ℃恒温培养箱反应20 min。使用酶标仪检测412 nm波长处的光密度值，扣除ATCI因非酶催水解所产生的光密度值，确定是否可以用光密度值代表AChE活性。结果显示，该酶促反应体系的光密度值随着AChE浓度的升高而升高；但当AChE浓度超过0.425 U/mL时，该酶促反应体系的光密度值趋于平稳，提示底物的水解产物含量趋于稳定，反应达到相对平衡；因此，选择最佳AChE酶促反应浓度为0.425 U/mL。见OSID码图3。

1.2.4 最佳底物浓度确定 取150 μL的PBS，37 ℃水浴预热5 min，依次加入不同浓度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的ATCI 20 μL、15 mmol/L DTNB 20 μL、0.425 U/mL AChE 20 μL，37 ℃恒温培养箱反应20 min，使用酶标仪检测412 nm波长处的光密度值。结果显示，在AChE浓度为0.425 U/mL时，该酶促反应体系的光密度值随着底物ATCI浓度的升高而升高；当底物ATCI浓度大于15 mmol/L时，该酶促反应体系的光密度值趋于平稳；因此，选择最佳底物ATCI浓度为15 mmol/L。见OSID码图4。

1.2.5 不同浓度PAS840对AChE活性的抑制作用观察 采用改良的Ellman法［8-10］，按照上述已筛选出的最佳AChE、ATCI浓度进行实验。在96孔板中依次加入37 ℃预热5 min后的PBS 150 μL，加入最佳浓度为0.425 U/mL的AChE 20 μL，15 mmol/L的DTNB 20 μL，再分别加入浓度为7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250 μg/mL的PAS840，以及最佳浓度为15 mmol/L的底物ATCI各20 μL，37 ℃恒温培养箱反应不同时间（0、5、10、15、20、25、30 min）；加入1% SDS 20 μL终止反应，酶标仪检测412 nm波长处的光密度值，记为OD样。每个浓度做3个平行，每个平行设置样品、空白和本底三个对照。由于本实验的样品PAS840有颜色，所以每个样品同时做一个本底扣除，用PBS 20 μL替代ATCI底物溶液，酶标仪检测其412 nm波长处的光密度值（以OD值表示），记为OD底。用PBS代替AChE作为空白对照，酶标仪检测其412 nm波长处的光密度值，记为OD空。绘制不同作用时间加入不同浓度的PAS840后AChE催化ATCI分解的光密度—时间曲线，以其斜率反映AChE催化ATCI分解的速率。

1.2.6 不同浓度PAS840的AChE抑制率测定 参照文献［4］的方法，按照“1.2.2”“1.2.3”“1.2.4”筛选出的最佳条件进行实验，加入PAS840的浓度为15.625、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL，按照“1.2.5”的方法测定光密度值，并计算各浓度PAS840对AChE活性的抑制率［11］。AChE活性抑制率=（OD空-OD样+OD底）/OD空×100%。绘制不同浓度PAS840作用后的AChE抑制率曲线，采用GraphPad Prism5软件得到PAS840抑制AChE催化ATCI分解的半数抑制浓度（IC50）。

1.2.7 PAS840对AChE活性的抑制类型分析 确定AChE浓度为0.425 U/mL，选择不同浓度（3.75、7.5、15、30、60 mmol/mL）的底物ATCI，采用改良的Ellman法测定光密度值，绘制AChE催化ATCI分解的反应速率（V）随底物浓度（S）变化的曲线，即米氏方程曲线。结果显示，在相同底物浓度条件下，随着PAS840浓度的升高，AChE催化ATCI分解的反应速率降低，即PAS840的抑制活性增强，见OSID码图5。该反应体系酶促反应速率增加的原因是底物浓度的非线性增加，这种趋势符合米氏方程规律，可采用米氏方程相关的酶动力学实验测定PAS840对AChE的抑制类型［12］。采用双倒数作图法，绘制不同浓度PAS840作用后，AChE催化ATCI分解反应速率的倒数（1/V）随底物浓度的倒数（1/S）变化的曲线，即不同浓度PAS840对AChE抑制作用的双倒数曲线，通过双倒数曲线判断抑制类型，包括竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合性抑制［13］。

1.3 美洲大蠊提取物PAS840的抗氧化活性观察

1.3.1 PAS840对DPPH自由基的清除能力观察采用DPPH法。参照姚旭等［10］的方法并稍作改动，称取1.971 6 mg的DPPH，加入无水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液，取不同浓度（3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250 μg/mL）的PAS840溶液或维生素C（VC）1 mL，再加入DPPH溶液1 mL，充分混合均匀。23 ℃避光放置30 min，0.25 μm微孔滤膜过滤，取滤液250 μL于96孔板中，517 nm处测定光密度值（以A表示），以此表示DPPH自由基含量，光密度水平越低表明清除的DPPH自由基越多，其抗化活性越强。DPPH自由基清除率=1-［（A样-A底）/A空］×100%，其中A空为1 mL无水乙醇加1 mL DPPH溶液的光密度值、A样为1 mL样品溶液加1 mL DPPH溶液的光密度值、A底为1 mL样品溶液加1 mL无水乙醇的光密度值。采用ELISA Calc回归/拟合程序软件计算PAS840清除DPPH自由基的IC50。

1.3.2 PAS840对铁氰化钾的还原能力观察 采用总还原能力测定法。在4 mL离心管中分别加入浓度为0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH 6.6），分别加入不同浓度（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL）的PAS840溶液或Vc 0.2 mL，加入1%铁氰化钾0.5 mL，混合均匀。50 ℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸0.5 mL终止反应，0.25 μm微孔滤膜过滤。加入去离子水0.5 mL和0.1%三氯化铁0.1 mL，涡旋仪混合均匀，静置10 min。取250 μL混合液于96孔板中，检测700 nm处的光密度值（以B表示）［10］。铁氰化钾还原率=（B空-B样）/B空×100%，其中B空为空白对照液的光密度值、B样为加入样品溶液后的光密度值。采用ELISA Calc回归/拟合程序软件计算PAS840还原铁氰化钾的IC50。

1.3.3 PAS840对羟自由基的清除能力观察 采用水杨酸法。取9 mmol/L FeSO41 mL，加入到4 mL离心管中，再加入10 mmol/L水杨酸—乙醇溶液1 mL，依次加入不同浓度（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0 mg/mL）PAS840溶液或Vc溶液1 mL，最后加入3% H2O21 mL作为显色剂。37 ℃水浴反应30 min，以蒸馏水为参比，检测510 nm下的光密度值（以C表示）。羟自由基清除率=1-［（C样-C底）/C空］×100%，其中C空为空白对照液的光密度值、C样为加入样品溶液后的光密度值、C底为不加显色剂H2O2样品溶液本底的光密度值。采用ELISA Calc回归/拟合程序软件计算PAS840清除羟自由基的IC50。

2 结果

2.1 不同浓度PAS840对AChE的活性抑制作用比较 随着PAS840浓度的升高，AChE催化ATCI分解的光密度—时间曲线斜率逐渐降低，提示PAS840对AChE催化反应进程具有抑制作用，且随着作用浓度和时间的增加，其抑制作用更为明显。见OSID码图6。

2.2 不同浓度PAS840的AChE抑制率比较 随着PAS840浓度的增加，AChE抑制率先逐渐升高再趋于平缓；见OSID码图7。PAS840抑制AChE活性的IC50为22.30 μg/mL。

2.3 PAS840对AChE的活性抑制类型 双倒数曲线分析结果显示，不同浓度PAS840作用后，几条直线均相交于第二象限，且在横坐标轴和纵坐标轴的交点均不同，AChE的表观米氏常数随PAS840浓度的增加而增加，而最大酶促反应速率减小；这提示PAS840对AChE的活性抑制类型是混合性抑制。见OSID码图8。

2.4 不同浓度PAS840、Vc对DPPH自由基的清除率比较 随着浓度的增加，PAS840、Vc对DPPH自由基的清除率均呈先升高后平稳的趋势；500 μg/mL PAS840对DPPH自由基的清除率为93.95%，同等浓度Vc的清除率为97.31%；见OSID码图9。PAS840清除DPPH自由基的IC50为43.21 μg/mL。

2.5 不同浓度PAS840、Vc对铁氰化钾的还原率比较 随着浓度的增加，PAS840对铁氰化钾的还原率呈先升高后平稳的趋势，Vc对铁氰化钾的还原率呈比较高的平稳趋势；3.0 mg/mL PAS840对铁氰化钾的还原率为78.20%，同等浓度Vc的还原率为82.20%；见OSID码图10。PAS840还原铁氰化钾的IC50为0.498 mg/mL。

2.6 不同浓度PAS840、Vc对羟自由基的清除率比较 随着浓度的增加，PAS840对羟自由基的清除率呈比较中等的平稳趋势，Vc对羟自由基的清除率呈逐渐升高趋势；1.8 mg/mL PAS840对羟自由基的清除率为45.72%，其后逐渐趋于平缓，同等浓度Vc的清除率为74.06%；3.0 mg/mL PAS840对羟自由基的清除率为47.83%，同等浓度Vc的清除率为89.73%；见OSID码图11。PAS840清除羟自由基的IC50为3.65 mg/mL。

3 讨论

神经退行性疾病是一类认知能力下降且不可逆的选择性与进行性神经元功能障碍疾病，其中研究最多的是AD。目前，针对AD的发病机制有多种假说，包括氧化应激假说、炎症假说、胆碱能损伤假说、β淀粉样蛋白级联假说及Tau蛋白异常修饰假说等，其中最具代表性的是胆碱能损伤假说［14］。该假说认为，各种原因引起的大脑基底前脑胆碱能神经元损伤，以及大脑皮层及海马等区域的胆碱能神经传递受损，在AD患者记忆及认知功能损伤过程中均具有重要作用［15］。AChE是人体大脑中生物信号传导的关键酶之一，能催化神经递质乙酰胆碱水解为胆碱和乙酸，进而阻碍大脑中神经信号的传递［16］。研究表明，痴呆程度与胆碱能含量有重要关系，而AChE活性与乙酰胆碱水平呈负相关关系［17］。因此，抑制AChE进而提高乙酰胆碱水平也就成了治疗AD的重要途径之一［18］。

我国是传统中药资源大国，传统医学对AD一类神经退行性疾病的预防及治疗也有着悠久的历史。中药素以多组分、多靶点、多途径发挥作用著称，在许多病因不明的疑难杂症中常收获奇效。美洲大蠊提取物PAS840是从美洲大蠊乙醇提物中提取，经大孔树脂吸附及水、醇水洗脱后，减压蒸馏，冷冻干燥得到的。本研究结果显示，美洲大蠊提取物PAS840具有较强的AChE活性抑制作用，IC50达22.30 μg/mL；PAS840对AChE的抑制类型为混合性抑制。这表明PAS840既可以和游离酶单独结合，也可以与酶和底物复合物结合，从而抑制AChE的催化活性。

研究表明，AChE抑制剂可刺激胆碱能神经，从而减轻心肌梗死（MI）大鼠的交感迷走神经失衡、缺血性心律失常、炎症、氧化应激和细胞凋亡［19］。氧化应激可能是许多疾病的诱发因素，被认为在衰老过程中具有重要作用。氧化损伤是衰老的标志，被认为可导致多种年龄相关疾病的发生，也包括AD等神经退行性疾病。研究表明，具有抗氧化或抗炎特性的多靶点定向化合物是治疗AD的有效药物，如作为抗氧化剂和抗神经炎症剂的羽扇豆醇已被发现对AD的氧化应激反应具有积极影响［20］。

DPPH是一种较稳定的自由基，文中通过测定DPPH自由基清除率为清除自由基活性的检测提供了一个理想又简单的药理模型。研究表明，铁物质在体内能产生最有害的自由基物质，即羟自由基，羟自由基在体内会引起氧化应激，从而导致一系列氧化应激相关疾病的发生［21］。羟自由基是体内最活跃的活性氧，作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，可造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱，如引发不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，并损伤膜结构和功能等。因此，羟自由基清除能力是检测抗氧化能力的重要指标之一。本研究显示，美洲大蠊提取物PAS840清除DPPH自由基的IC50为43.21 μg/mL，还原铁氰化钾的IC50为0.498 mg/mL，清除羟自由基的IC50为3.65 mg/mL。

综上所述，PAS840具有较强的AChE活性抑制作用和抗氧化活性，对神经退行性疾病及其他因氧化应激而引起的疾病可能具有潜在的治疗作用，其药用价值仍需进一步的体内动物实验进行验证。