清炒番石榴叶的炮制工艺研究

邓仙梅 甘柯林 唐铁鑫 曹娟娟

肇庆医学高等专科学校，广东 肇庆 526020

番石榴叶为桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaLinn.的干燥叶。春、夏季采收，晒干或鲜用。其性平，味甘、涩，归大肠、肝经。具有涩肠止泻、收敛止血的功效。临床上入汤剂用于治疗泄泻，下痢不止；外用治疗皮肤湿疹瘙痒，跌打损伤，创伤出血[1]。番石榴叶是广东地区常用中草药，国医大师邓铁涛教授就非常善于用单味番石榴叶治疗泄泻。此外，它还具有很好的降血糖保健作用，素有天然的“胰岛素”之美称，是众多糖尿病患者选择的保健茶疗方。很早以来民间就流传着一句话“血糖高不用愁，炒番石榴叶来解忧”。市面上也一直有炒番石榴叶茶包卖。李丹等[2]研究发现：炒番石榴叶安全剂量大；炒番石榴叶能降低 STZ 糖尿病大鼠血糖水平，作用机制可能与增强肝脏GK、GLUT2、IGF-1、IRS-1基因表达有关。

据现有文献资料报道，有关番石榴叶的现代研究主要集中在其化学成分[3-12]、药理作用[10-18]及临床应用方面[19-21]，其中有几篇是关于其炮制品药理作用研究的文献。但尚不见有关于番石榴叶的炮制工艺研究报道，故本实验拟对番石榴叶的清炒炮制工艺进行研究，为炒番石榴叶的现代生产工艺提供实验依据，保证炒番石榴叶的饮片质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；BP124S型、BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)；KQ250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 金丝桃苷(批号：C13469877，Macklin，CAS：482-36-0，质量分数≥98.8%HPLC)；槲皮素(批号：C12374611，Macklin，CAS：117-39-5，质量分数≥98.8%HPLC)。水为纯化水(超纯水机，广州盟欧仪器有限公司)；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。实验用番石榴叶药材于2021年9月采自广东茂名高州，经广东药科大学中药学院刘基柱副教授鉴定为桃金娘科植物番石榴PsidiumguajavaL.的干燥叶子。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定金丝桃苷、槲皮素的含量

2.1.1 对照品溶液的制备 分别取金丝桃苷、槲皮素对照品7.75 mg、5.75 mg，精密称定，分别置于5 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度，配成浓度分别为1.55 mg/mL，1.15 mg/mL的对照品母液，于4 ℃冰箱中保存备用。分别精密吸取金丝桃苷、槲皮素对照品母液100 μL、150 μL置于5 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液定容至刻度，配制成浓度分别为31 μg/mL，34.5 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粉末1.2 g，精密称定，加入25 mL 60%乙醇溶液，称定重量，液超声提取30 min。取出放冷至室温，加入60%乙醇溶液补足减失的重量。用 0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 色谱条件及专属性试验 色谱柱：Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A) -0.2% 磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～15 min，11%～13.5% A；15～30 min，13.5%～18% A；30～40 min，18% A；40～65 min，18%～49% A；65～70 min，49%～11% A)；检测波长：360 nm；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃[7]。

按照以上方法条件进行专属性试验，结果如图1。在该方法下测定清炒番石榴叶样品的金丝桃苷、槲皮素含量，专属性强，稳定可行。

图1 60%乙醇空白试液、混合对照品、炒番石榴叶样品的HPLC图

2.1.4 线性关系考察 分别吸取“2.1.1”项下的混合对照品溶液2 μL、3 μL、5 μL、10 μL、15 μL、30 μL、45 μL，按“2.1.3”项下的色谱条件进行测定。以各成分的进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归分析，得回归方程为：金丝桃苷Y=1541.1X+68.198 (R2=0.9860)，槲皮素Y=2395.9X+9.0884 (R2=0.9999)。

2.1.5 精密度试验 吸取“2.1.1”项下的混合对照品溶液10 μL，按“2.1.3”项下的色谱条件进行测定，连续平行测定6次，记录各对照品的峰面积。结果金丝桃苷、槲皮素的峰面积RSD值分别为0.32%、0.45%。该结果表明仪器精密性良好。

2.1.6 稳定性试验 精密吸取“2.1.2”项下的样品试液10 μL，分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h 进样测定，记录峰面积。结果金丝桃苷、槲皮素的峰面积RSD值分别为1.21%、1.34%。表明该样品溶液在18 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 按照“2.1.2”项下的供试品溶液制备方法平行制备6份供样品溶液，按“2.1.3”项下的色谱条件进行进样测定，记录峰面积。结果金丝桃苷、槲皮素的峰面积RSD值分别为0.65%、0.84%。表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收试验 取已知含量的样品粉末0.6 g，精密称定，然后按1∶1的比例加入金丝桃苷、槲皮素对照品，再按照“2.1.2”项下的提取方法制备加样供试品溶液，平行制备6份。然后吸取各份加样样品溶液10 μL进样分析，记录峰面积，并计算加样回收率。结果金丝桃苷、槲皮素的加样回收率为98.2%、100.1%，RSD值分别为1.15%、2.01%。表明该方法准确性良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 炒制温度 称取30 g 番石榴叶生饮片，平行称取5份，分别在80 ℃、120 ℃、150 ℃、180 ℃、200 ℃清炒2 min，测定其金丝桃苷、槲皮素的含量。结果见表1。即选定炒制温度的范围是120～180 ℃。

表1 不同炒制温度样品的含量和外观性状

2.2.2 炒制时间 称取30 g 番石榴叶生饮片，平行称取4份，在180 ℃下分别炒0.7 min、2 min、3 min、4 min，测定其金丝桃苷、槲皮素的含量。 结果见表2。即选定炒制时间的范围是0.7～2 min。

表2 不同炒制时间样品的含量和外观性状

2.2.3 投药量 称取30 g 、50 g、80 g、100 g番石榴叶生饮片，分别在180 ℃下炒2 min，测定其金丝桃苷、槲皮素的含量。结果见表3。即选定投药量的范围是30～80 g。

表3 不同投药量样品的含量和外观性状

2.3 正交试验 根据预试验和单因素试验结果可知，炒制温度A、炒制时间B以及投药量C对清炒番石榴叶饮片质量都有一定影响，故本试验以金丝桃苷、槲皮素含量的加权评分OD值为主要评价指标(OD=金丝桃苷含量/金丝桃苷最大值×0.5×100+槲皮素含量/槲皮素最大值×0.5×100)，成品的外观性状作为参考评价指标，选取L9(34)正交表对炒制温度、炒制时间以及投药量这3个因素进行考察。结果见表4、表5、表6。

表4 正交设计因素水平表

表5 正交试验优选清炒番石榴叶的炮制工艺结果

表6 方差分析

根据表4结果可知，各因素影响大小次序为炒制时间(B)>炒制温度(A)>投药量(C)，其最佳工艺为A3B2C3。表4方差分析结果表明炒制温度(A)和炒制时间(B)对OD值有显著性影响，但投药量(C)对OD值无显著性影响。结合清炒番石榴叶外观性状特点综合分析确定清炒番石榴叶的最佳炮制工艺为A3B2C1，即180 ℃清炒2 min，投药量为30 g。

2.4 最佳工艺验证 取同批番石榴叶按照“2.3”项下所确定的最佳炮制工艺进行制备清炒番石榴叶，平行做3份，测定其金丝桃苷、槲皮素含量。结果见表7。验证试验结果表明本次试验优选的清炒炮制工艺稳定可行。

表7 最佳工艺验证结果

3 讨论

现代研究[22]表明，金丝桃苷在多种疾病中具有多种生物活性，具有抗氧化应激和细胞凋亡、抗急性肝损伤、抗肿瘤、抗炎、抗癌、抗抑郁、抗高血糖等作用。槲皮素具有止泻、抗氧化、抗病毒、抗炎作用，在细胞和动物实验中可以用来治疗肝、心、脾、肺、肾、骨科疾病、神经系统疾病等[23-24]。由此可见，金丝桃苷、槲皮素均为番石榴叶中的重要活性成分，故本试验选择这2种成分含量的加权评分作为工艺评价指标，可以很好地标示其饮片质量。

从“2.2”项下的单因素试验结果可知，在番石榴叶中金丝桃苷含量随着炒制的温度升高而降低，而槲皮素含量则是随着炒制的温度升高而升高。在一定温度下，番石榴叶中金丝桃苷含量随着炒制时间的延长而降低，而槲皮素含量则是随着炒制时间的延长而升高。槲皮素作为其重要的止泻成分但在生品中的含量很低，清炒后可大大提高槲皮素含量，提高有效成分煎出率。此外，番石榴叶清炒过后可缓解其苦涩之味，改善口感。故建议用番石榴叶治疗腹泻时选择炒番石榴叶。本试验所确定的清炒番石榴叶的炮制工艺可为炒番石榴叶的生产提供实验指导，具有一定的实际意义。