基于“脑心同治”探讨电针不同介入时间对创伤性脑损伤后认知障碍的影响

郭文慧,张 卫,郑淑美,苑鸿雯,张 璐,王天琪,崔学慧,崔 海△,杜若桑△

1.首都医科大学,北京 100069;2.宣武中医医院,北京 100050

创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是由外力所导致的一种后天性脑损伤,可能导致脑功能暂时或永久性的伤害[1]。目前全世界TBI的发病率约为5 000万例/年,造成的经济损失约为4 000亿美元,约占世界生产总值的0.5%[2]。TBI的发病机制是一个复杂的过程,主要可分为原发性损伤和继发性损伤[3]。原发性损伤与大脑受到的原发性外部撞击直接相关,而继发性脑损伤可在原发性撞击发生后数分钟至数天内发生,出现炎症反应、神经元死亡、小胶质细胞的激活以及自由基释放等病理变化,会进一步加剧脑组织损伤[4]。

炎症反应被证实与认知障碍之间存在极其密切的关系,后者是TBI最常见的后遗症之一[5],不同损伤程度的TBI会引起长、短期认知障碍,不仅严重影响患者的生活质量,同时也阻碍患者的早期康复[6]。有研究显示通过抑制脑组织内神经炎症,可减轻大鼠认知障碍,增强学习记忆能力,改善神经功能损伤[7]。而促炎因子IL-1β、IL-18表达水平的高低,对于检测TBI后认知功能损伤程度具有一定的导向作用。针刺作为中医重要组成部分,广泛应用于TBI后认知障碍、意识障碍与肢体活动障碍等症状[8]。亦有诸多研究关注针刺的起效机制,针刺可通过抑制炎性反应、调节神经递质、促进神经修复、抗氧化、抑制细胞内钙超载、调节细胞能量代谢、改善脑循环及抑制细胞凋亡等多途径治疗TBI[9]。

根据中医理论,心脑均与神志相关,正如张锡纯所言:“神明之功用,原心与脑相辅相成”“神明之体藏于脑,神明之用发于心”。脑为髓海,主精神意识和感觉运动。心藏神,总统魂魄《素问·灵兰秘典论》云:“心者,君主之官,神明出焉”,TBI后认知障碍的发生与心脑密切相关,治疗宜从调理脑心功能、脑心同治入手。

课题组前期研究结果表明2/100 Hz疏密波电流下的电针治疗能够更加有效地缓解TBI大鼠的神经炎症,同时也能有效地提高大鼠的学习与记忆能力[10],但是其针对TBI后认知障碍的最佳干预时间仍未确定。基于此,本研究采用“脑心同治”针刺法,利用大鼠TBI模型,通过观察炎症反应进一步探讨不同介入时间点对TBI后认知障碍的疗效差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用7～8周龄SPF级雄性SD大鼠80只,体质量280～320 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司[生产许可SCXK(京)2016-003]提供,于首都医科大学实验动物中心SPF级国家标准实验室[SYXK(京)2018-0003]分笼饲养,每笼3只。饲养温度(22±3)℃,湿度40%～50%,12 h/12 h昼夜周期,均可自由摄食、饮水,适应性饲养7 d。动物造模以及实验研究过程严格遵守动物福利伦理原则,本研究经首都医科大学动物伦理委员会批准通过(批号:AEEI-2023-043)。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 β-actin单克隆抗体(Abcam,货号:ab8227);IL-18兔源一抗(Proteintech,货号:10663-1-AP);IL-1β兔源一抗(Abcam,货号:ab283818);彩虹预染蛋白Maker(苏州新赛美生物科技有限公司,货号:P9006);HPR-山羊抗兔IgG(Proteintech,货号:SA00001-2);594-山羊抗兔IgG(Abcam,货号:ab150080);FJB染液(Merck Life Sciences,货号:AG310)。

1.2.2 仪器 精密颅脑损伤撞击器PCI3000(美国Hatteras instruments公司);68025型脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命技术有限公司);华佗牌一次性无菌针灸针(0.3 mm×13 mm,苏州医疗用品厂有限公司);电泳、电转仪套装(美国加利福尼亚州Bio-Rad);化学发光、凝胶成像系统(美国加利福尼亚州Bio-Rad)。

1.3 造模方法

采用随机数字方法将80只SPF级雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、电针1组、电针2组与电针3组,每组均为16只。

除假手术组外,其余4组大鼠利用PCI3000制备TBI模型。本实验全过程均采用异氟烷吸入麻醉法,3%异氟烷诱导大鼠麻醉后调为2%用以维持,大鼠头部备皮俯卧于脑立体定位仪上。沿大鼠矢状缝切一条长约1.5 cm的切口,使大鼠的前囟能完整暴露,以前囟右旁开约2.5 mm、后1.5 mm处为圆心,用微型手持式颅钻钻取直径大约为6.0 mm的孔,打开骨窗并保持硬脑膜完整。除假手术组外其余组均用PCI3000进行撞击(撞击参数为撞击头直径:4.0 mm;打击速度:4 m/s;打击深度:2.5 mm;停留时间:100 ms),撞击完后清理创口,还纳骨窗并用组织胶水封闭,随后缝合伤口。

1.4 干预方法

电针1组、电针2组以及电针3组分别在造模结束后即刻、造模结束后第3天以及造模结束后第7天开始电针干预。所有电针组取穴均为“水沟”(DU26)、双侧“风池”(GB20)和双侧“内关”(PC6),穴位定位及选取参照华兴邦等制定的《实验动物常用穴位名称与定位》[11]。操作:2%异氟烷麻醉大鼠后俯卧位固定,向上斜刺水沟约1 mm,捻转10 s后出针不留针;内关直刺约2 mm,风池斜刺3 mm;风池、内关两穴行平补平泻手法后连接电针仪。电针参数采用疏密波,频率2/100 Hz,电流强度以大鼠身体轻微抖动为度,留针15 min,1次/d,连续针刺14 d。干预期间假手术组与模型组只麻醉不进行针刺干预。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 大鼠神经功能缺损评分 在大鼠造模结束后1 d、14 d以及21 d采用神经功能评分表(modified neurological severity scores,mNSS)对各组的神经功能缺损情况进行评价[12],综合评价大鼠运动(肌肉状态以及异常动作)、感觉(如视觉、触觉及平衡觉等)以及反射反应。测试得分越高则表示大鼠的神经损伤功能损伤程度越严重,本测试满分为18分。

1.5.2 新物体识别实验 于造模后21 d对大鼠的学习记忆功能进行评估,实验持续3 d。第1天将大鼠放置于一个空旷的铁皮箱中,进行时长5 min的环境适应训练。第2天在箱子中放置两个大小、质地和颜色一样的物体,让大鼠进行时长为5 min的探索;训练后1.5 h进行短期记忆保留训练,训练时长为5 min,训练过程中将两个物体中的一个替换成另外一个颜色、质地一样但是形状不一样的新物体,训练并分别记录大鼠探索新旧物体的时间。24 h后进行长期记忆保留训练,再次将两个旧物体中的一个替换成一个颜色、质地一样但形状不同的新物体,其他不变,训练并记录大鼠探索新旧物体的时间。最后分别计算短期记忆保留试验以及长期记忆保留试验中各组大鼠的新物体探索时间比:(探索新物体时间/总探索时间)×100以及对新旧物体的偏好指数:(探索新物体时间-探索旧物体时间)/总探索时间[13]。

1.5.3 水迷宫实验 于造模后第28天进行定位航行实验和空间探索试验,分别对大鼠的学习记忆以及空间定位功能进行评估。定位航行实验:水迷宫实验前4 d,将大鼠面朝池壁,顺时针分别从4个不同的象限下水,平台固定于第2象限,取大鼠在除平台所在象限外其他3个象限寻找平台所花费的时间的平均值作为衡量空间学习能力的指标。空间探索实验:水迷宫实验第5天撤去平台,将大鼠放入水池并记录2 min,记录大鼠穿越原平台的次数,用以衡量大鼠空间记忆能力。

水迷宫试验结束后每组随机选取8只大鼠进行灌注取脑,将大脑浸泡于4%多聚甲醛中24 h,随后进行石蜡包埋、制作切片用于FJB染色、HE染色和后续免疫荧光试验。各组剩余8只大鼠经异氟烷麻醉后,快速取出大脑,剥离损伤灶周围皮层组织用于Western blot检测。

1.5.4 Fluoro-jade B染色 采用FJB染色法检测大鼠患侧海马区神经元细胞退行性变异情况。脑切片经脱石蜡、复水后,用梯度环保脱蜡液脱蜡,再用梯度乙醇脱水,最后用蒸馏水洗涤,然后滴加FJB工作液,50%冰醋酸为溶剂,按1∶400配制FJB工作液,稀释FJB绿色荧光探针,4 ℃过夜。DAPI染核8 min,最后用蒸馏水冲洗。切片晾干后,经二甲苯洗涤,最后封片。染色图像在直立荧光显微镜(Nikon,日本)下观察和拍摄,放大倍数为400×,使用Image-pro plus 7.0软件测量和计数阳性细胞。

1.5.5 HE染色法观察大鼠损伤侧大脑海马区脑组织形态学变化 将脑组织浸泡在4%多聚甲醛(4 ℃)中24 h,然后用石蜡包埋组织,用显微切割机将石蜡包埋的组织切成5 μm厚的切片。切片用二甲苯脱蜡,再用梯度乙醇(100%～75%)脱水。用双蒸水冲洗后,将切片放入苏木精溶液中浸泡3～5 min,然后用曙红溶液染色5 min。最后用中性树胶装片。HE染色图像由计算机辅助图像分析系统捕获,该系统由放大倍率为400×的显微镜组成。

1.5.6 Western blot法检测大鼠损伤侧大脑皮层IL-1β、IL-18蛋白表达 取50 g大鼠右侧大脑皮层,用RIPA裂解液提取其蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度,取上清液加入5×SDS-PAGEA蛋白上样缓冲液和PBS制成样本储存液。将样本加入电泳槽中进行电泳、转膜和封闭,随后分别加入IL-1β一抗(1∶1 000)、IL-18(1∶8 000)和β-actin(1∶1 000),4 ℃慢摇过夜,次日洗膜后加入山羊抗兔IgG室温孵育1 h(1∶20 000),加入增强化学发光显影。Image J软件计算目的条带与相应内参灰度值的比值,作为目的蛋白的最终表达水平。

1.5.7 免疫荧光法检测大鼠损伤侧大脑皮层IL-1β、IL-18阳性表达 取5 μm脑切片后经二甲苯脱蜡,无水乙醇等修复抗原。羊血清封闭,滴入一抗IL-1β(1∶50)抗体或IL-18(1∶200)抗体,放入染色暗盒中,孵育过夜,随后加入稀释过的FITC的羊抗兔二抗(1∶100)IgG。孵育1 h后,染核封片,荧光显微镜(200×)观察染色结果并拍照分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

各组大鼠造模后1 d、14 d及21 d神经功能缺损情况见表1。造模后1 d,除假手术组外,各组评分均呈上升趋势,差异有统计学意义(P<0.05),但组间差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠mNSS神经损伤功能评分比较

造模后第14天及第21天mNSS评分结果显示各组大鼠得分均有所下降,但模型组评分明显高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,各电针组评分均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),其中电针1组得分最低。见表1。

2.2 各组大鼠海马组织形态比较

应用FJB染色和HE染色观察脑组织病理改变,首先,笔者团队采用FJB染色法对TBI大鼠海马区神经元细胞退行性变异情况进行检测,见图1。统计学结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠海马区的FJB阳性细胞数量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),经过电针治疗后,各电针组海马区FJB阳性细胞数量较模型组有所减少,差异有统计学意义(P<0.05),且电针1组与假手术组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注:绿色荧光染色代表脑组织中神经元坏死细胞,尺标长度=50 m。图1 FJB染色结果

表2 各组大鼠FJB相对表达水平比较

此外,在HE染色中假手术组大鼠右侧大脑海马区组织结构清晰完整,形态正常,颜色淡染均匀,未见病理损伤灶;而与假手术组比较,模型组大鼠大脑右侧海马区有明显的病理改变,主要表现为右侧海马区组织结构疏松,神经细胞数量减少,细胞核皱缩坍塌,或有空泡样改变。与模型组比较,电针1组、电针2组和电针3组大鼠右侧大脑海马区脑组织病变程度有所改善,主要表现为神经细胞数量增多、细胞核皱缩坍塌以及空泡样改变减少,且与其他电针组比较,电针1组的改善情况更趋近于假手术组。结果显示,电针治疗可以减轻TBI后海马区的病理改变,且干预时间越早,疗效越显著。见图2。

图2 各组大鼠右侧大脑海马区HE染色结果(标尺=200 m)

2.3 各组大鼠新物体识别实验比较

新物体识别实验在造模后第21天进行,结果见表3,分析各组大鼠短期记忆训练中对新物体探索时间比以及偏好指数结果发现,在探索时间比中,与假手术组比较,模型组探索时间比值较低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,经过电针治疗后电针组探索时间比值均有所提升,差异有统计学意义(P<0.05),其中电针1组与假手术组差异无统计学意义(P>0.05);在短期记忆训练的偏好指数测试中,与假手术组比较,模型组的偏好指数显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),电针1组与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,电针1组的偏好指数略高,差异有统计学意义(P<0.05);电针2组、电针3组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠新物体识别实验记忆偏好指数及探索时间比统计比较

短期记忆训练结束后24 h对各组大鼠进行长期记忆训练,结果显示在探索时间比中,与假手术组比较,模型组探索比比值显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较电针组的探索比比值均较高,差异有统计学意义(P<0.05);且3个电针组与假手术组比较,结果差异均无统计学意义(P>0.05);但相比之下电针1组的比值略高于电针2组以及电针3组,差异有统计学意义(P<0.05)。在长期记忆训练的偏好指数测试中,模型组的偏好指数明显低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组的偏好指数均有所回升,差异有统计学意义(P<0.05),且电针1组与假手术组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 各组大鼠水迷宫实验结果比较

水迷宫实验在造模后第28天开始,包括定位航行试验以及空间探索实验。在定位航行实验中,笔者团队对各组大鼠逃避潜伏期进行比较分析后发现,随着训练日期增加,各组大鼠寻找平台的逃避潜伏时长均明显减少。各组大鼠水迷宫实验前4 d逃避潜伏期分析结果显示,与假手术组比较,模型组逃避潜伏期时长明显延长,差异有统计学意义(P<0.01);而经过电针治疗后,各电针组的逃避潜伏时长较模型组均明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05),其中电针1组逃避潜伏期时长与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、表4。

图3 各组大鼠水迷宫前4 d寻找平台潜伏期时长

表4 各组大鼠水迷宫1～4 d潜伏期时长比较

在空间探索实验中对撤除平台后各组大鼠穿越原平台次数进行分析比较发现:与假手术组比较,模型组穿越平台的次数明显减少(P<0.01);与模型组比较,电针1组、电针2组和电针3组穿越平台的次数均增加(P<0.05);电针1组与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 各组大鼠水迷宫实验最后1 d穿越平台次数比较

比较分析各组大鼠水迷宫实验第1天以及第4天从同一下水点下水后的游泳轨迹图,结果显示,随着训练日期的增加,各组大鼠寻找平台的时间以及路径均有所缩短,较之于其他组,假手术以及电针1组大鼠寻找平台的轨迹更为清晰明确,花费的时间最短,见图4。这些研究结果表明,电针治疗能够有效改善TBI后学习与记忆能力,其改善程度与电针干预时间的早晚密切相关。

图4 各组鼠水迷宫第1 d和第4 d游泳轨迹代表图

2.5 各组大鼠脑组织中IL-1β、IL-18蛋白表达比较

Western blot结果见图5,统计学结果见表6,与假手术组比较,模型组大鼠患侧大脑皮层IL-1β、IL-18的表达明显上升,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,经过电针治疗后电针1组、电针2组和电针3组IL-1β、IL-18的蛋白表达均有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05),且电针1组IL-1β、IL-18表达和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 各组大鼠患侧大脑皮层IL-1β、IL-18蛋白水平

表6 各组大鼠患侧大脑皮层IL-1β、IL-18蛋白表达结果

2.6 各组大鼠脑组织中IL-1β、IL-18阳性表达比较

笔者团队通过免疫荧光检测各组大鼠患侧大脑皮层IL-1β、IL-18表达情况,与假手术组比较,模型组大鼠患侧大脑皮层中IL-1β、IL-18的分布均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,经过电针治疗后各电针组IL-1β、IL-18的分布有所减少,差异具有统计学意义(P<0.05),其中电针1组下降的更为明显,值得注意的是,电针1组与假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,电针治疗能够有效抑制促炎因子的表达,有助于缓解TBI大鼠神经炎症。见图6、表7。

注:a.各组大鼠患侧大脑皮层IL-1β分布情况;b.各组大鼠患侧大脑皮层IL-18分布情况。红色荧光表示各蛋白阳性表达,蓝色荧光表示细胞核,标尺=20 m。图6 免疫荧光染色结果

表7 各组大鼠右侧大脑患侧皮层IL-1β、IL-18分布结果

3 讨论

TBI是全世界导致年轻群体发病和死亡的主要原因之一,对患者的生活质量产生严重的影响。据报道,TBI后损伤涉及大脑皮质的额叶、颞叶、顶叶、枕叶以及海马等多个区域,会对患者的执行功能、前瞻性记忆功能、延迟记忆功能、命名、注意力与定向力等方面造成严重影响,最终导致认知障碍[14]。本研究结果显示TBI模型大鼠均存在神经功能缺损、学习与记忆功能减退现象,且TBI大鼠海马组织出现神经元细胞数量减少、大量神经元细胞出现退行性变异等病理变化,脑组织中促炎因子IL-1β、IL-18表达水平显著上升。电针“内关”“风池”“水沟”可以降低TBI大鼠mNSS神经功能评分,提高其学习与记忆能力,减轻脑组织病理变化情况,抑制神经炎症,这与既往相关研究结果一致[15-18]。既往研究结果表明TBI是神经退行性疾病发生发展的重要风险因素之一,其继发的认知障碍作为该疾病的常见临床症状在过去几十年中受到的关注日益增多。然而,TBI后认知障碍发生发展的具体分子机制还未明晰[19]。因此,迫切地需要找到更加有效的治疗策略来缓解这一疾病的发展。笔者团队的研究结果表明,电针治疗可以改善TBI大鼠的认知障碍水平,其部分原因是通过对神经炎症的抑制作用,且据结果推测,越早干预对疾病的改善程度越明显。

从中医角度分析,TBI后认知障碍多属于中医学的“呆病”“健忘”“善忘”等范畴[20],有学者[15]认为,头为诸阳之会,内涵脑髓,一旦损伤则脑髓震动,瘀阻清窍,清阳浊阴升降失调而发为健忘痴呆等。由此可见TBI后认知障碍的发生与脑密切相关。《黄帝内经》中记载:“人始生,先成精,精成而脑髓生”“头者,精明之府,头倾视深,精神将夺矣”,阐明脑与人体精神活动发生发展密不可分[21],同时《黄帝内经》中还有记载:“心者,君主之官,神明出焉”“神气舍心,魂魄并具,乃成为人”,心与神志密不可分[22]。后世医家张锡纯在《医学衷中参西录》中提出:“人之神明,原在心与脑两处”,由此可知人的精神意识思维皆与心、脑密不可分。目前也有学者提倡脑心同调治疗神志、认知等疾病。脑心同治法对于疾病的临床治疗具有极大的指导意义,如魏宝钰[23]运用清脑益智方,通过心脑同治法探讨其改善血管性痴呆大鼠脑血流量的相关机制,结果显示,清脑益智方能够激活脑微血管内皮细胞中AMPK/eNOS信号通路而促进NO的合成,同时舒张脑微血管和改善心功能,从而增加血管性痴呆大鼠的脑血流量,改善其认知功能。李洁等[24]在脑心同治治疗思路下,选用内关、水沟与神门等穴位联合利培酮治疗精神分裂症患者,结果显示其具有改善患者注意力、语言能力、记忆力、视空间及执行能力等认知方面的优势作用,卓佳兵等[25]通过心脑同治针刺法结合认知康复训练,显著改善了脑梗死患者的认知能力。本研究选取风池、水沟和内关3个穴位,其中“风池”穴位于脑后部,是足少阳胆经的腧穴,该穴具有补脑益智、醒脑开窍的作用[26];“水沟”属督脉,督脉“入属于脑”,此穴是醒脑开窍针刺法的主穴之一,具有开窍启闭、醒脑神调脏腑的作用;“内关”穴为手少阴心包经之络穴,心包经代心受邪,针刺此穴可起到滋养心神、疏通气血的作用。内关穴其下有正中神经,而现代医学中正中神经电刺激可起到治疗意识和认知障碍的作用,从侧面为内关治疗认知和意识障碍提供了科学性依据。本实验选用的风池穴、内关穴及水沟穴,通过调理心或脑的功能,脑心同治,共奏醒脑开窍、调神益智之功效,对TBI后认知障碍起到改善作用[27-28]。

根据既往的实验及临床结果显示,介入时间点是针刺疗效的决定性因素之一,目前临床上应用针刺治疗创伤性脑损伤、脑卒中等脑病多在恢复期,确定发病早期针灸治疗的有效性将扩大临床上针灸的干预窗口期。已有研究者发现早期针刺介入能更好地改善脑卒中患者的临床症状,他们推测发病6～48 h是针刺介入脑卒中的最佳时期[29-30]。刘勇等[31]为研究针刺介入时机对缺血性中风大鼠脑组织神经细胞中特异性磷酸酶(PTEN)、高磷酸化蛋白激酶(p-AKT)以及磷酸化糖原合酶激酶(p-GSK3)表达的影响,分别在造模后2 h、72 h以及168 h进行针刺。结果显示造模后2 h进行针刺治疗能够更好地抑制缺血性中风大鼠脑组织神经细胞细胞凋亡,保护和修复受损神经元细胞,疗效较好。课题组前期研究表明造模后即刻开始针刺能降低大鼠血清(胶质纤维酸性蛋白)GFAP和S-100B蛋白水平,还可提高TBI大鼠脑内GLT-1 mRNA的表达,抑制谷氨酸兴奋毒性,减轻神经炎症,降低细胞凋亡,从而减轻脑损伤,明显减轻大鼠脑损伤的程度[27,32],但仍缺乏关于电针不同介入时间对创伤性脑损伤后认知障碍影响的研究。本研究经过比较发现造模后即刻开始针刺相比造模后第3天、造模后第7天针刺,能更显著地改善认知功能。

综上所述,本实验表明电针介入时间越早,即伤后即刻开始针刺对TBI后认知障碍的疗效最好,具体表现在降低IL-1β、IL-18的表达,减少炎症和神经细胞死亡数量,改善神经功损伤,提高大鼠学习记忆能力和水平,这为临床上何时应用针刺治疗TBI患者提供科学依据。后续在本实验的基础上,笔者团队将进一步深入探讨电针治疗TBI后认知障碍的机制,为针刺的有效性和科学性提供依据。