NLRP3炎症小体在葡萄膜炎中的研究进展

周 敏,胡秋明

0引言

葡萄膜炎是一组累及虹膜、睫状体、玻璃体、视网膜、脉络膜为主的炎症疾病总称,是世界范围内致盲眼病之一。炎症反应在葡萄膜炎的发生和发展中起着关键作用,其病因复杂,发病与细菌、病毒以及自身免疫性疾病密切相关[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体是一种细胞内多聚体蛋白复合物,它在炎症和免疫反应中起着重要作用。NLRP3炎症小体可识别外源性病菌入侵和内源性细胞损伤的危险信号,激活、调控炎症反应,抵抗感染与应激损伤,但其过度激活则会导致组织的炎症损伤[2-3]。目前,国内外已经有大量实验表明,NLRP3炎症小体在葡萄膜炎发病机制中发挥着重要的调控作用。因此,通过研究NLRP3炎症小体在葡萄膜炎中的作用,深入了解其在疾病发展过程中的具体机制,通过干预NLRP3炎症小体的活性,调节炎症反应的程度,从而减轻葡萄膜炎的症状和病情,这将为开发新的治疗思路和新药物提供方向,也为葡萄膜炎的基础研究和临床治疗新靶点提供重要的意义。本文将综述其相关的研究进展。

1 NLRP3炎症小体

核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族是一个重要的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs),当识别微生物成分中的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)、损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)等时,由内源性应激产生,触发下游炎症通路,以消除微生物感染和修复受损组织。NLRs家族蛋白含有共同的特征性结构：C端富含亮氨酸重复结构域(leucine-rich repeat,LRR)、中心核苷酸结合结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NBD)及N端蛋白-蛋白作用结构域(pyrin-like domain,PYD),其中具有可变性的PYD是NLRs家族蛋白不同亚型的区分标志[4]。炎症小体主要为Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白(Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein,NLRP),目前在葡萄膜疾病中研究最广泛且最深入的是NLRP3炎症小体。

1.1NLRP3炎症小体的结构及功能NLRP3作为先天免疫系统中的重要传感器,通过形成NLRP3炎症小体,激活caspase-1的超分子复合物来监测外源性病原体入侵和内源性细胞损伤并做出反应。NLRP3炎症小体由3个主要成分构成：Nod样受体蛋白3(NLRP3)、细胞凋亡相关的微粒蛋白(ASC)以及半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)。NLRP3是一个感受器蛋白,它能够感知细胞内的多种刺激信号,包括感染、细胞应激、氧化应激和细胞损伤等,能捕获危险信号并启动下游免疫。ASC是一个适配蛋白,它能够连接NLRP3和caspase-1,从而促进炎症小体的形成和活化。caspase-1是一个重要的炎症介导酶,能够切割和激活多种炎症因子,诱导细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟;或通过膜穿孔蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)活化诱导细胞焦亡[5-6]。

PRRs启动的天然免疫应答是机体抵御病原体入侵、维持内环境稳态的第一道防线[3,7]。NLRP3是细胞质中重要的PRR,同样具有3个结构域：LRR结构域、中心核苷酸结合域(NACHT)以及含有CARD的凋亡相关颗粒蛋白(ASC)的氨基端热蛋白结构域(PYD)。LRR结构域主要介导蛋白与蛋白之间的相互作用,还参与维持NLRP3的稳定性：生理条件下,NACHT与LRR结合使NLRP3炎症小体处于抑制状态。NACHT结构域具有结合核苷酸和水解ATP的能力,激活后,能通过ATP依赖的自身寡聚化,产生PYD相互作用,进一步招募连接蛋白ASC。PYD通常以同型方式相互作用,调控下游信号[8]。

ASC包含N端PYD和C端caspase募集结构域(CARD)。它通过同型PYD-PYD相互作用被招募到寡聚化的NLRP3分子的簇状PYD上,形成ASC有核细丝。这些有核细丝聚集ASC的C端CARDs,作为连接效应分子caspase-1的平台[9-11]。caspase-1由N端的CARD、大的催化亚基p20和C端的小的催化亚基p10组成[12]。激活后的caspase-1能够切割并激活负责细胞焦亡的gasdermin D(GSDMD)[13-14],并将IL-1、IL-18促炎细胞因子裂解为成熟的促炎细胞因子,对调节免疫反应至关重要[15-17]。

1.2NLRP3炎症小体的激活NLRP3炎症小体的激活受到严格的调控,其激活机制极其复杂。迄今为止,研究表明NLRP3炎症小体可通过3种不同的信号通路被激活。

1.2.1经典NLRP3炎症小体激活途径经典激活途径需要两个步骤：“启动”和“激活”。首先,NLRP3通过识别PAMPs或DAMPs参与免疫和炎症反应的细胞因子来启动。在启动阶段,Toll样受体、细胞因子受体或NLRs的配体可以诱导转录因子NF-κB的激活,促进NLRP3和pro-IL-1β的表达[18]。当“启动”NLRP3后,通过引起离子流(如K+外排[19]、Cl-外排[20]、Na+内流[21]、Ca2+信号失调[22]等)、线粒体功能障碍、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的释放[23-25]、溶酶体破裂和反式高尔基体解聚[26]等多种分子和细胞途径,从而激活炎症小体。

1.2.2非经典NLRP3炎症小体激活途径研究表明,NLRP3炎症小体激活还存在一条caspase-11(人体内caspase-4和caspase-5)依赖的非经典NLRP3炎症小体信号通路[27-29]。在小鼠巨噬细胞中,启动信号对于非经典炎症小体的激活是必不可少的,然而在表达caspase-4的人类细胞中,启动信号对于非经典的NLRP3炎症小体激活并不是必需的[30-31]。最近的研究表明,当革兰氏阴性菌感染后,干扰素诱导蛋白IRGB10以鸟苷酸结合蛋白(GBP)依赖的方式直接靶向细菌的细胞膜,破坏细菌结构完整性,并将配体LPS和类脂A释放到细胞质中[32-33]。LPS和类脂A可直接结合鼠源caspase-11的CARD结构域或人源caspase-4和caspase-5,导致caspase寡聚化和自溶[30],而活化的caspase-4/5/11蛋白可水解小鼠gasdermin D(GSDMD)的Asp276 (人GSDMD的Asp275)位点,释放N端结构域,与胞膜上的心磷脂、磷脂酰肌醇磷酸酯和磷脂酰丝氨酸结合,诱导孔道形成和细胞焦亡[14,34]。

1.2.3选择性NLRP3炎症小体激活途径新的研究还发现了另一种的NLRP3炎症小体激活途径,即选择性NLRP3炎症小体途径。在该途径中,单独的TLR配体不足以激活caspase-1或诱导人和猪单核细胞中IL-1β的成熟和分泌[35]。选择性通路需要通过上游的TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8信号通路激活,也需要NLRP3-ASC-caspase-1信号,但这种新的炎症小体缺乏经典途径和非经典途径相关特征。有研究表明,载脂蛋白C3(ApoC3)能激活人单核细胞中caspase-8依赖的选择性NLRP3炎症小体。ApoC3能通过TLR-SCIMP-Lyn-Syk-TRPM2轴与Tlr2和Tlr4相互作用诱导其异源二聚化,进而促进Ca2+内流、ROS产生、NADPH氧化酶和caspase-8活化[36-37],但caspase-8与NLRP3炎症小体激活以及作用机制还需要进一步的研究与探索。

2葡萄膜炎

2.1流行病学及现状葡萄膜炎是一组累及虹膜、睫状体、脉络膜、葡萄膜、视网膜、视网膜血管以及玻璃体的眼部炎症性疾病,其引起的眼部并发症包括并发性白内障、渗出性视网膜脱离、视神经萎缩、青光眼等,是造成视力损害和失明的重要原因[38-42]。当前,未能及时治愈的葡萄膜炎严重威胁着患者的视力健康。在全球,5%-10%的视力损害由葡萄膜炎引起,据统计,葡萄膜炎在发达国家的发病率约为(17-52)/100000人年,患病率为(38-714)/100000人[43-44]。

2.2葡萄膜炎症性质的分类按炎症的性质,葡萄膜炎可分为感染性与非感染性。感染性葡萄膜炎主要与细菌、病毒、结核、弓形虫、寄生虫等因素有关;而非感染性葡萄膜炎主要与自身免疫有关,一般会合并有全身免疫性疾病,如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化等[1]。

3 NLRP3炎症小体与葡萄膜炎

3.1NLRP3炎症小体与Behcet病Behcet病(BD)是一种以口腔、生殖器、葡萄膜、皮肤等多种组织的动静脉同时受累的慢性、复发性炎症为特征的全身多系统自身免疫性疾病[45]。目前对该疾病的发病机制尚不完全清楚,但研究表明,NLRP3炎症小体在Behcet病的发展中起到重要作用。Eun-So Lee团队检测了15例活动期、15例稳定期BD患者和15例健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMCs),与健康对照组相比,BD患者的NLRP3炎症小体在mRNA和蛋白水平上表达均显著增加[46]。其中25例伴有结节性红斑患者中NLRP3和ASC的表达增加明显。众所周知,IL-1β是一种独特的促炎症细胞因子,是自身炎症性疾病的基础[47]。IL-1β可通过TLR2/4和ROS-NLRP3炎症小体依赖途径,触发肽聚糖和脂多糖参与Behcet病的发病[48]。在Özören的一项研究中,将Behcet病的患者分为血管型、皮肤黏膜型和眼部损害型,实验研究显示：血管型受累的BD患者在LPS刺激后IL-1β和TNF-α水平高于眼部受累型、皮肤黏膜受累的BD患者和健康对照者[49]。同时,这项研究也表明了不同类型BD患者之间细胞因子分泌谱可能存在差异,揭示不同类型的BD存在不同的发病机制。使用人源化的抗IL-1β抗体XOMA 052治疗患有急性眼内炎症的BD患者,7例受治疗的患者炎症均减轻[50],这也证明了IL-1β在BD发病机制中确实发挥着重要的作用。而IL-1β作为NLRP3炎症小体通路中分泌的重要炎症细胞因子,这也表明未来有望通过下调NLRP3炎症小体抑制IL-1β分泌从而减轻BD的炎症反应。在Tüzün团队的研究中还分析并探讨了5例伴随有神经症状的Behcet病(NBD)患者在发作期和缓解期的外周血单个核细胞(PBMC)样本,使用实时荧光定量PCR检测发现了DEFA1B和NLRP3蛋白基因表达显著上调[51]。同时,又在Hamzaoui等[52]的研究中得到证实,检测伴有神经症状的NBD患者的脑脊液和血清分析发现IL-32和NLRP3炎症小体在NBD患者中表达增加。NLRP3炎症小体可能是IL-32释放的重要介质,是潜在的治疗靶点。在BD治疗方面,一项RCT实验研究了关于补锌对BD病患者NLRP3炎症小体的调控作用。在50例BD患者中发现,3 mo的葡萄糖酸锌补充(30 mg/d)对白细胞中NLRP3和caspase-1基因的表达明显降低,并有效缓解了BD患者的炎性症状[53]。基于以上研究也表明,在未来,调控NLRP3炎症小体有望成为Behcet病治疗的有效新靶点。

3.2NLRP3炎症小体与Vogt-小柳原田综合征Vogt-小柳原田综合征(VKH)是一种自身免疫性疾病,以双侧肉芽肿性全葡萄膜炎为特征,全身受累包括白发症、白癜风、脱发、中枢神经系统和听觉障碍等。其发病病因以及机制尚不完全清楚,可能与病毒感染以及免疫反应有关,但具体的机制并不是很明确[54-55]。在Liang等[56]的研究中,VKH患者在细胞中也发现了异常的炎症小体的激活,这些患者单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)产生IL-1β和ROS水平升高,下调NLRP3或抑制ROS均可抑制IL-1β的产生。因此,NLRP3的活化水平升高提示该炎症小体在VKH综合征发病机制中发挥着作用。然而,目前对于NLRP3炎症小体在VKH中的作用和治疗潜力的研究仍然缺乏,需要进行更多的实验研究和临床试验来进一步验证NLRP3炎症小体在VKH中的作用,并开发出更有效的治疗策略。

3.3NLRP3炎症小体与内毒素诱导的葡萄膜炎在眼表疾病以及眼前段炎症中,NLRP3炎症小体也发挥着重要的作用[57]。人类急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis,AAU)的研究模型主要以内毒素诱导葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)动物模型为主,它不是一种自身免疫过程,而是由注射细菌内毒素脂多糖类(LPS)触发。在模型中,注射LPS(皮下或腹腔注射)后,在24 h内可以观察到快速但短暂的前葡萄膜炎[58-60]。该模型对于研究急性眼部炎症感染过程的各个方面以及不同的治疗干预措施非常有用。Rosenzweig等[61]通过采用免疫印迹法检测NLRP3、ASC和caspase-1的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β水平发现了：NLRP3、ASC和caspase-1蛋白在眼组织中呈组成性表达,在EIU过程中,IL-1β蛋白产生增加,而且这需要caspase-1和NLRP3的共同存在。然而,敲除caspase-1或NLRP3基因的大鼠并没改变EIU的严重程度。Lei等报道了一种新型抗炎小分子VVN001能有效抑制NLRP3炎症小体的激活,减轻EIU小鼠炎症反应[62]。Ildefonso等[63]也研究了一种来自黏液瘤病毒的M013免疫调节蛋白。在EIU中,该蛋白能干扰NLRP3炎症小体和NF-κB在内的促炎信号通路,明显减少玻璃体内炎症细胞的数量和显著降低IL-1β的浓度。目前,NLRP3炎症小体和EIU之间的具体作用机制仍然还不明确,这也是一个备受关注的研究领域。探索NLRP3炎症小体在EIU中的激活途径以及其作用机制对于该疾病的发病机制和寻找新的治疗方法具有重要意义。

3.4NLRP3炎症小体与实验性自身免疫性葡萄膜炎实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)是一种人类内源性葡萄膜炎的动物模型,是通过视网膜S抗原(solubleanti-gen,S-Ag)、视网膜光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoin-binding protein,IRBP)、视紫红质等自身抗原诱导EAU产生[58]。病变部位主要位于视网膜、葡萄膜,是常用的人类非感染性葡萄膜炎的模型,与人类的交感性眼炎、VKH和眼结节病等有相似的临床特点和病理特征[64]。Kumar等[65]检测了补体膜攻击复合物(MAC)和NLRP3炎症小体在正常和不能组装补体膜攻击复合物的C9/小鼠EAU发病机制中的作用。实验中发现MAC是EAU中NLRP3炎症小体活化和IL-1β产生的重要调节因子。相反,MAC和NLRP3炎症小体在C9/小鼠中没有升高,更出乎意料的是,MAC的抑制剂sCD59的递送成功地减弱了NLRP3炎症小体的激活和减轻了EAU病理反应。虽然,NLRP3炎症小体的作用在葡萄膜炎的发生发展中已被证实,但机制并不明确,更多的研究者在探讨其机制及调控通路。侯圣平的研究团队证实了NLRP3可通过调控P-SIK1/SREBF1通路抑制AIM2炎症小体介导的EAU,并突显了靶向NLRP3的治疗潜力[66]。树突状细胞(DCs)是抗原呈递细胞,通过分泌IL-18和IL-1β参与T细胞活化和葡萄膜炎的致病过程。魏琳团队在EAU模型DC中发现可溶性CD83(sCD83)与GTP酶Ras相关蛋白(Rab1a)可相互作用,促进Rab1a在自噬溶酶体中积累,并抑制mTORC1磷酸化和NLRP3表达。沉默Rab1a可降低活化DCs中NLRP3的表达,而Rab1aQ70L过表达能够恢复sCD83诱导的活化DCs中NLRP3的表达[67]。这为研究NLRP3炎症小体在葡萄膜炎中的作用机制提供了新思路。

4结语

综上所述,本文通过阐明NLRP3炎症小体的结构、生物学功能、激活通路以及其与不同类型的葡萄膜炎相关机制方面的研究,发现了NLRP3炎症小体在人类葡萄膜炎和动物模型的葡萄膜炎中的异常活性,下调NLRP3炎症小体活性能有效缓解葡萄膜炎的炎症反应,但其详细的分子机制尚不明确。目前,葡萄膜炎的治疗主要依靠抗炎药物和免疫抑制剂等,但这些治疗方法存在一定的局限性,未来可以通过深入研究NLRP3炎症小体的激活、信号传导途径以及与其他细胞因子的相互作用,进一步明确NLRP3炎症小体在葡萄膜炎中的具体作用机制,并有望通过调控NLRP3炎症小体的激活通路上的相关炎性因子、基因和蛋白的表达,成为葡萄膜炎基础研究的新方向和临床治疗的新靶点。