基于中性粒细胞胞外诱捕网探讨白及修复溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障的作用及机制

陈霞，樊官伟，蒲翔，陈云志，孔祥艳，陈帅，柴艺汇，王飞（.贵州中医药大学，贵州 贵阳 55005；.天津中医药大学，天津 009；.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 55000）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种慢性复发性炎症性疾病，可见结肠黏膜出现红斑、糜烂、出血以及溃疡等情况[1]。UC患者常出现不同程度排便频繁及直肠出血症状，严重者还可能出现发热、血红蛋白下降等全身体征，并伴有肠穿孔、中毒性巨结肠的风险[2]。据统计[3]，我国UC患者发病率约为11.6/10万，国外发病率约为我国的4～7倍，且呈逐年上升趋势。目前用于治疗UC的常用药物包括皮质类固醇、免疫调节剂、生物制剂等[4]，虽有一定疗效，但价格昂贵，且长期使用可能会产生恶心、呕吐、库欣综合征及骨髓抑制等不良反应[5]。因此，积极寻找并开发高效、低毒副作用的抗UC药物具有重要的临床意义及社会价值。

UC的发病机制复杂，其中肠黏膜屏障受损是其发病的重要病理生理基础[6]，修复肠黏膜屏障是改善肠道功能、缓解UC临床症状的主要途径[7]。研究[8]表明，中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）的形成可能是诱发UC中肠道屏障功能损伤的原因之一。中药白及始载于《神农本草经》，具有生肌敛疮、收敛止血的作用，其多种活性成分可促进结肠黏膜损伤的修复，增强黏膜屏障的防御功能[9]。研究[10]显示，白及能通过抑制NETs的表达治疗肺损伤，提示白及具有调控NETs生成的作用。因此，本研究拟基于NETs探讨白及修复UC大鼠肠黏膜屏障的作用及机制，为其临床应用及开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级SD大鼠48只，雌雄各半，体质量（200±20）g，购自贵州中医药大学动物研究所，实验动物生产许可证号：SCXK（黔）2021-0003，动物质量合格证号：10662350000017。本动物实验方案经贵州中医药大学动物实验伦理审查委员会批准，伦理编号：20210101。

1.2 药物及试剂白及，购自北京本草方源药业科技有限公司，批号：201201，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.ex Murray）Rchb.f.的干燥块茎。称取白及饮片100 g，加入10倍量蒸馏水浸泡后煎煮2次，过滤后合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至浓度为0.12 g·mL-1，置于4℃冰箱中冷藏备用。

柳氮磺胺吡啶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：S129986；2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS），美国Sigma公司，批号：P2297；HE染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号：20220105；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）ELISA检测试剂盒，江苏晶美生物科技有限公司，批号：JM-01587R2、JM-01454R2；GAPDH抗体，杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R001；血管内皮生长因子（VEGF）抗体、髓过氧化物酶（MPO）抗体，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：19003-1-AP、22225-1-AP；封闭蛋白2（Claudin-2，CLDN2）抗体、闭锁小带蛋白1（Zonula occludens-1，ZO-1）抗体、中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase，NE）抗体，美国Affinity公司，批号：AF0128、AF5145、AF0010；羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0010、A0208；粪便隐血定性检测试剂盒，北京雷根生物科技有限公司，批号：1206A21。

1.3 主要仪器Multiskan MK3型酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；JXSTPRP-24L型组织匀浆机，上海净信实业发展有限公司；BMJ-A型组织包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪，常州市中威电子仪器有限公司；BA210Digital型数码三目摄像显微镜，厦门麦克奥迪实业集团有限公司；ChemiDocTM蛋白电泳免疫印迹系统，美国伯乐公司；HI650型离心机，湖南湘仪实验室仪器公司；DYY-7C型电泳仪电源、DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYCZ-40型电转仪，北京六一仪器厂；TS-1型水平摇床，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。

1.4 分组、模型复制及给药将48只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组（0.3 g·kg-1）及白及低、中、高剂量组（0.3、0.6、1.2 g·kg-1），每组8只。除正常组外，其余各组采用TNBS-乙醇溶液灌肠法复制UC大鼠模型[11]：将5%TNBS溶液（100 mg·kg-1）混合于0.25 mL 50%乙醇溶液中，待大鼠麻醉后，将灌肠软管于肛门缓慢推入离大鼠肛门约8 cm的结肠部位，灌肠1次；并在尾高头低体位下放置5 min，以避免TNBS溶液流失，待大鼠苏醒后放回笼中继续饲养；正常组大鼠以同样方法灌肠等体积生理盐水。以大鼠出现体质量减轻、腹泻、粪便沾肛以及便中带血作为模型复制成功的标志。造模成功后次日开始，各给药组按照设定剂量灌胃给药，正常组和模型组大鼠每天灌胃等体积生理盐水，灌胃体积10 mL·kg-1，每日1次，连续灌胃给药21 d。

1.5 大鼠疾病活动指数（Disease activity index，DAI）测定分别在给药干预的第1、11、21天测量并记录大鼠的体质量下降百分率。观察大鼠粪便性状，用棉签采集豆粒大小粪便于滤纸上，使用粪便隐血定性检测试剂盒测定大鼠粪便隐血情况，并拍照记录。根据体质量下降百分数、粪便性状及粪便隐血情况，计算：DAI=（体质量下降百分率评分+粪便性状评分+粪便隐血评分）/3。DAI评分标准[12]见表1。

表1 大鼠疾病活动指数评分标准Table 1 Disease activity index scoring criteria for rats

1.6 样本采集末次灌胃给药后，大鼠禁食、不禁水24 h后进行取材。采用2%戊巴比妥钠（2 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠后，腹主动脉取血，以3 000 r·min-1（离心半径=14 cm）低温离心15 min，分离上层血清，-80℃冰箱中保存待测。解剖大鼠取自肛门上部约2 cm处至盲肠端整个结肠组织，并钝性分离脂肪等结缔组织；沿肠系膜纵轴切开，用生理盐水清洗干净[13]。选取肛缘处往上约8 cm的结肠组织，部分于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色和免疫组化（IHC）检测；其余分装冻存于-80℃冰箱，用于蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测。

1.7 HE染色法观察大鼠结肠组织病理变化将4%多聚甲醛溶液固定后的结肠组织进行梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋后切片；切片经二甲苯脱蜡、HE染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，在光学显微镜下观察结肠组织病理变化并拍照。对结肠组织进行病理评分，评分标准[14]见表2。

表2 大鼠结肠组织病理评分标准Table 2 Pathological scoring criteria for colon tissue in rats

1.8 ELISA法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量取各组大鼠血清样本，梯度解冻，按照ELISA检测试剂盒说明书步骤进行标准品及样本加样、加酶、37℃恒温孵育、洗涤、显色等操作，显色终止后用酶标仪在450 nm下检测吸光度，根据标准曲线计算样品中TNF-α、IL-1β含量。

1.9 Western Blot法检测大鼠结肠组织中M PO、NE、VEGF、ZO-1、CLDN2蛋白表达水平将大鼠结肠组织冻存样本梯度解冻，于冰上剪碎；每20 mg加入200μL裂解液，采用匀浆机制备结肠组织匀浆；以12 000 r·min-1（离心半径=14 cm）离心20min，取上清；采用BCA法测定蛋白浓度后加入稀释液、Loading buffer制备跑胶样本，-80℃保存。按照制胶试剂盒说明书步骤配制凝胶，上样后进行电泳、转膜；用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，加入一抗GAPDH（1∶1 000）、MPO（1∶2 000）、NE（1∶1 000）、VEGF（1∶1 000）、CLDN2（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000），4℃下孵育过夜；次日TBST洗膜后，加入相应二抗（1∶5 000），常温下摇床孵育2 h；TBST洗去二抗后，滴加ECL发光显影液于PVDF膜，显色曝光、扫描胶片；采用BandScan软件测定各蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.10 免疫组化法检测大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、ZO-1、CLDN2蛋白表达水平将4%多聚甲醛溶液固定的结肠组织进行脱水、包埋、切片、脱蜡；然后，按照免疫组化检测常规步骤进行抗原修复、阻断内源性过氧化物酶；血清封闭后，加入相应一抗并在4℃下孵育过夜；经二抗孵育、显色、复染、脱水后，封片。使用显微摄像系统对切片进行图像采集，先在×100镜下观察整体组织，再分别于×400镜下采集3个视野显微图像；使用Halo数据分析系统计算每张图像阳性面积占比（%），取3个视野的阳性面积占比的平均值作为结肠组织中对应蛋白的阳性表达水平。

1.11 统计学处理方法采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白及对UC大鼠DAI的影响结果见图1。灌胃给药第1天，与正常组比较，其余各组大鼠的DAI评分均＞2分，DAI明显升高（P＜0.05），表明造模成功。给药第11天，与模型组比较，各给药组大鼠的DAI均有所下降，其中柳氮磺胺吡啶组效果较明显（P＜0.05）。给药第21天，与模型组比较，各给药组大鼠的DAI均明显降低（P＜0.05）。结果表明，白及能改善UC大鼠体质量下降、腹泻、便血等一般症状。

注：A.正常组；B.模型组；C.柳氮磺胺吡啶组；D.白及低剂量组；E.白及中剂量组；F.白及高剂量组。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05图1 白及对溃疡性结肠炎大鼠疾病活动指数（DAI）的影响（±s，n=8）Figure 1 Effect of Bletillae Rhizoma on disease activity index（DAI）in rats with ulcerative colitis（±s，n=8）

2.2 白及对UC大鼠结肠组织病理变化的影响结果见图2。正常组大鼠结肠组织黏膜结构完整，腺体排列密集清晰，未出现明显炎性细胞浸润。与正常组比较，模型组大鼠结肠组织黏膜层出现大面积变性坏死且肠腺结构消失，大量炎性细胞浸润，累及黏膜下层、肌层和浆膜层，病理评分明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和白及中、高剂量组大鼠结肠肠腺结构完整清晰，黏膜未见明显变性及坏死，可见少量炎性细胞浸润，病理评分明显降低（P＜0.05）。结果表明，白及能明显改善UC大鼠结肠组织的病理损伤。

注：A.正常组；B.模型组；C.柳氮磺胺吡啶组；D.白及低剂量组；E.白及中剂量组；F.白及高剂量组。HE染色（×100），标尺=100μm。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05图2 白及对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理变化的影响（±s，n=6）Figure 2 Effect of Bletillae Rhizoma on pathological changes of colonic tissue in ratswith ulcerative colitis（±s，n=6）

2.3 白及对UC大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影响结果见图3。与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显升高（P＜0.05）。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和白及中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显降低（P＜0.05），白及低剂量组大鼠血清IL-1β水平明显降低（P＜0.05）。结果表明，白及能降低UC大鼠的血清炎性因子TNF-α、IL-1β水平。

注：A.正常组；B.模型组；C.柳氮磺胺吡啶组；D.白及低剂量组；E.白及中剂量组；F.白及高剂量组。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05图3 白及对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影响（±s，n=6）Figure 3 Effects of Bletillae Rhizoma on serum TNF-αand IL-1βlevels in ratswith ulcerative colitis（±s，n=6）

2.4 白及对UC大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、ZO-1、CLDN2蛋白表达的影响Western Blot检测结果见图4，免疫组化检测结果见图5。与正常组比较，模型组大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、CLDN2蛋白表达明显升高（P＜0.05），ZO-1蛋白表达明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，柳氮磺胺吡啶组和白及中、高剂量组大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、CLDN2蛋白表达明显降低（P＜0.05），ZO-1表达明显升高（P＜0.05）。结果表明，白及能通过下调UC大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、CLDN2蛋白表达，上调ZO-1蛋白水平来改善结肠黏膜损伤。

注：A.正常组；B.模型组；C.柳氮磺胺吡啶组；D.白及低剂量组；E.白及中剂量组；F.白及高剂量组。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05图4 白及对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、CLDN2、ZO-1蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 4 Effects of Bletillae Rhizoma on the protein expressions of MPO，NE，VEGF，ZO-1 and CLDN2 in colonic tissues of rats with ulcerative colitis（±s，n=3）

注：A.正常组；B.模型组；C.柳氮磺胺吡啶组；D.白及低剂量组；E.白及中剂量组；F.白及高剂量组。免疫组化染色（×400），标尺=40μm。与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05图5 白及对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中MPO、NE、VEGF、CLDN2、ZO-1蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 5 Effects of Bletillae Rhizoma on the protein expressions of MPO，NE，VEGF，CLDN2 and ZO-1 in colonic tissues of rats with ulcerative colitis（±s，n=3）

3 讨论

溃疡性结肠炎（UC）是一种炎症性肠病，大量炎性因子浸润、肠道黏膜屏障受损是其主要病理特征[15]。TNF-α是UC炎症过程中引起持续免疫失调的重要细胞因子，也是介导肠道黏膜损伤的关键因素[16]。IL-1β是炎症过程中相关生物反应的重要诱导物，能通过启动和放大炎症反应参与肠道损伤[17]。TNBS-乙醇灌肠是常用的UC造模方法，乙醇作为有机溶剂损伤肠黏膜屏障，TNBS作为半抗原与体内蛋白结合形成抗原，导致一系列的肠道免疫反应，产生大量炎性因子，与人类所患UC具有相似的临床表现，因此本研究选择该方法造模[18]。本研究结果显示，利用TNBS-乙醇灌肠建立UC大鼠模型后，与正常组比较，模型组大鼠出现体质量下降、饮食减少、大便不成形以及便血等情况，结肠组织病理切片可见黏膜层大面积坏死、肠腺结构消失以及大量炎性细胞浸润等病理表现，且大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平明显升高，表明造模成功。而中药白及中、高剂量能明显改善大鼠体质量下降、腹泻、结肠黏膜层坏死、肠腺结构消失以及炎性细胞浸润等病理情况，并降低血清TNF-α、IL-1β水平，提示白及对UC大鼠结肠黏膜屏障病理损伤及炎症反应具有治疗作用。

紧密连接（Tight junction，TJs）是肠上皮细胞间的主要连接方式，由多股粘连跨膜分子封闭蛋白家族（Claudins，CLDNs）以及闭锁蛋白（Occludins，OCLNs）组成，通过细胞内闭锁小带蛋白（Zonula occludens，ZOs）连接到肌动蛋白细胞骨架，形成物理屏障，抵御有害物质入侵机体[19]。TJs控制着上皮内稳态、细胞旁通透性和屏障特性，其相关蛋白失调是导致肠道上皮细胞旁间隙扩张，诱发肠道炎症的重要原因之一，ZOs、CLDNs是TJs的主要组成成分，也是上皮细胞间相互连接的桥梁[20]，可防止病原体和有害抗原在上皮进行传播[21]。临床研究[22]证实，UC患者黏膜受损程度与ZO-1表达下调存在明显的关联性。CLDN2是一种在正常组织中较少表达，而在通透性增强的上皮组织中高度表达的“渗透性”连接蛋白，对维持肠道正常屏障功能起反向作用[23]，CLDN2过表达会导致阳离子和水通过细胞旁途径进入肠腔，从而引起漏泻性腹泻[24]。本研究显示，模型组大鼠结肠组织中CLDN2表达上调，ZO-1表达下调，而白及能上调结肠组织中ZO-1表达，并下调CLDN2表达，提示白及能有效调节UC大鼠结肠黏膜屏障损伤中关键蛋白的表达水平，是其改善UC的重要机制。

中性粒细胞是先天性免疫的主要效应细胞，通过吞噬和脱颗粒对抗感染，在机体损伤时会被募集到相关部位，激活产生中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），响应各种刺激[25]。而NETs是由DNA为骨架，NE、MPO等具有杀菌和增加通透性作用的蛋白附着而形成的网状结构[26]，其中NE和MPO的生成可作为检测NETs的可靠手段[27]。研究[28]发现，NETs网状结构在UC患者肠黏膜组织中大量生成，并在UC大鼠病变组织检测到NETs相关蛋白MPO和NE高度表达。这与本研究中模型组大鼠结肠组织中MPO、NE表达上调相符合。而白及能够下调UC大鼠结肠组织中MPO、NE表达，表明其可能对NETs激活具有一定调控作用。

未激活的中性粒细胞不会损伤上皮细胞，但在炎症刺激激活形成的NETs中，具有杀菌作用的活性因子及氧自由基会破坏上皮细胞，大量中性粒细胞迁移至黏膜的过程中会损害ZO-1表达，促进CLDN2生成，导致黏膜屏障的破坏[29]。中性粒细胞可以释放VEGF[30]，NE的生成也可以促进细胞质基质中VEGF的结合位点降解，导致其异常增多[31]，而VEGF过度表达会刺激血管通透性增加并导致纤维蛋白原渗出，促进病理性血管新生，增强机体炎症反应[32-33]。VEGF生成还可以诱导TJs相关蛋白泛素化，起到分解TJs相关蛋白的作用[34]。NETs还能直接诱导单核细胞来源的巨噬细胞产生TNF-α，刺激单核细胞分泌IL-1β，加重机体炎症反应[35]。上述研究表明，NETs的生成可以直接破坏TJs蛋白平衡，或间接通过调节VEGF及炎症因子的生成来破坏TJs相关蛋白的正常表达。本研究结果显示，白及能有效降低UC大鼠结肠组织中NETs相关蛋白MPO、NE、VEGF表达，并上调黏膜屏障相关蛋白ZO-1表达，下调CLDN2表达。

综上所述，中药白及可能通过调控NETs激活，下调结肠组织中NETs相关蛋白MPO、NE、VEGF表达，降低血清炎症因子TNF-α、IL-1β水平，调控肠黏膜屏障重要蛋白ZO-1、CLDN2表达，从而减轻UC大鼠结肠组织炎症浸润，修复肠道黏膜屏障，发挥治疗UC的作用。