木霉微生物菌肥的制备及对玉米茎腐病的应用评价

郭宁 孙华 马红霞 石洁 张海剑 刘树森 董跃广 温佳宇

摘要  以前期分离鉴定的生防菌株非洲哈茨木霉Tr35为研究对象，通过载体的筛选，制备木霉菌剂和木霉微生物菌肥。通过测定不同含量的木霉菌剂和木霉有机肥的株高、根长和鲜重，筛选促生效果明显的處理，并通过室内盆栽试验，评价其对玉米苗期茎腐病的防效。结果显示，玉米秸秆粉具有吸水性强、对Tr35无毒和高释放率的优点，与Tr35共同发酵制备木霉菌剂，当土与菌剂为5∶1时，促生效果明显，并对玉米苗期茎腐病防效达51.77%。菌剂土与腐熟羊粪为7∶1时的木霉有机肥促生效果最好，以该比例制备木霉微生物菌肥，对玉米苗期茎腐病防效达61.31%，该研究结果为Tr35菌剂和菌肥的应用开发提供了一定的前期基础。

关键词  玉米；非洲哈茨木霉；木霉菌剂；木霉微生物菌肥；玉米茎腐病

中图分类号  S435.131  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）09-0121-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Preparation of Trichoderma Microbia-fertilizer and Evaluation of Its Application to Maize Stalk Rot

GUO Ning， SUN Hua， MA Hong-xia et al

（Plant Protection Institute， Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/IPM Innovation Center of Hebei Province/International Science and Technology Joint Research Center on IPM of Hebei Province， Baoding， Hebei  071000）

Abstract  In the study， Tichoderma afroharzianum Tr35 obtained in the early stage was selected as the research object. Trichoderma agent and Trichoderma microbial fertilizer were prepared through carrier screening. By measuring the plant height， root length and fresh weight of Trichoderma agent and Trichoderma microbial fertilizer with different contents， the treatments with obvious growth promotion effect were screened， and the control effect of Trichoderma agent and Trichoderma microbial fertilizer on stalk rot of maize seedling was evaluated through indoor pot experiment. The results showed that maize stalk powder had the advantages of strong water absorption， non-toxic to Tr35 and high release rate.and co-fermented with Tr35 to prepare Trichoderma agent， had a significant growth promoting effect when the soil to fertilizer was 5∶1， and achieved 51.77% prevention effect on maize seedling stalk rot. The best growth promotion effect was achieved when the agent soil was 7∶1 with rotted sheep manure， Trichoderma microbial fertilizer was prepared in this proportion and the prevention effect of stalk rot on maize seedling reached 61.31%. The results provided a preliminary basis for the application and development of Tr35 agent and microbial fertilizer.

Key words  Maize;Tichoderma afroharzianum;Trichoderma agent；Trichoderma microbial fertilizer；Maize stalk rot

基金项目  河北省省级科技计划（20326516D）。

作者简介  郭宁（1983—），女，蒙古族，辽宁本溪人，副研究员，硕士，从事玉米病虫害研究。*通信作者，研究员，硕士，从事玉米病虫害研究。

收稿日期  2023-06-22

玉米是我国重要的粮、饲、经兼用型作物，玉米产业的可持续发展对保障我国粮食安全、促进农业发展起着至关重要的作用。

玉米茎腐病又称茎基腐病、青枯病，是世界范围内的一种典型土传病害，在我国各大玉米种植区均有发生，一般年份田间发病率在5%～10%，重发生年份田间发病率可达20%～30%，一些高感品种的发病率甚至达40%～100%［1-2］。目前，玉米茎腐病主要采用化学防治，但化学防治效果不显著，同时长期、大量化学药剂的施用导致的环境污染、农药残留以及食品安全等问题也随之而来。

木霉菌防治玉米茎腐病在国内外已有相关研究［3-8］，但由于生防菌施入环境后往往受土壤、气候和人为条件等因素的影响，在土壤中难定殖、防效不稳定，很难达到理想效果，大部分仍停留在实验室研究阶段，很难大面积推广应用，因此，目前国内并没有在玉米上登记使用的木霉菌菌剂。

研究表明，将生防菌添加到有机物料中是一种促进生防菌定殖并稳定发挥防效的重要方法［9］。微生物菌肥是一种环境友好的新型生物肥料，是将具有促生和抗病特性的微生物菌株，添加到有机物料中进行发酵而形成的一种有机肥料［10］。其中的微生物可以在土壤中大量繁殖，改善土壤环境，激发土壤活力，提高土壤肥力，起到促进植物生长和抑制有害病菌的目的。关于防治玉米茎腐病的玉米菌肥研究较少，因此，创制防治玉米茎腐病的生物菌肥具有重要意义。

笔者以非洲哈茨木霉为主要成分研制木霉菌剂及木霉微生物菌肥，并测试其对玉米茎腐病的防治效果，以期为后续生防菌肥的研发和推广应用提供依据，并为玉米茎腐病的生物防治提供理论支撑。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  菌株。

玉米茎腐病病原菌禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）和非洲哈茨木霉菌（Tichoderma afroharzianum）Tr35均由河北省农林科学院植物保护研究所分离并保存。

1.1.2  玉米品种。

郑单958，河南金博士股份有限公司

1.1.3  供试载体。

生物炭、腐熟鸡粪、腐熟羊粪、酒糟、玉米秸秆粉、麦麸、花生壳、泥炭土、腐质酸9种载体均为市购。

1.2  试验方法

1.2.1  供试菌株孢子发酵液的制备。

将Tr35接种于PDA平板，在28 ℃黑暗条件下培养4～7 d，待菌落充分生长，在其边缘打取菌饼（直径0.5 cm）10个，接种于PD液体培养基中（100 mL PD/250 mL三角瓶），于28 ℃、180 r/min振荡培养5 d。过滤去除菌丝体，得到孢子发酵液。将孢子浓度稀释成1×106个/mL。

1.2.2  载体对木霉菌的毒性分析。

分别称取灭菌后的9种供试载体10 g 装入盛有100 mL无菌水三角瓶中200 r/min 充分振荡混匀 2 h 后，用纱布过滤制得母液。母液过0.22 μm微孔滤膜，得到无菌液体。吸5 mL 上述无菌母液与45 mL PDA培养基混匀后倒平板，平板中心接种木霉菌的新鲜菌丝块（直径0.5 cm），重复 3 次，以加无菌水为空白对照。28 ℃培养箱中黑暗培养，至对照平板长满菌丝后，用十字交叉法测量各处理菌落直径，并计算抑制率。

抑制率＝（对照病原菌的菌落直径－处理病原菌的菌落直径）/（对照病原菌的菌落直径-0.5 cm）×100%

1.2.3  载体吸水性的测定。

供试载体研磨成粉末过60目筛，使用鼓风干燥箱105 ℃烘干至恒重。无菌条件下，将无菌水与10 g各供试载体材料充分混匀，少量多次加入无菌水，使载体材料保持湿润、疏松但不结块。以载体所含的液体量为载体吸水率，测定3次试验的平均值。

1.2.4  载体中有效菌体释放率的测定。

将菌株发酵液稀释至1×106孢子/mL备用。根据“1.2.3”结果将灭菌的供试载体中加入与无菌水等量的菌株发酵液，室温晾至干燥。48 h后，精确称取10 g供试载体，置于含有100 mL无菌水的锥形瓶中200 r/min充分混匀2 h后，用纱布过滤，显微镜下计数孢子量，计算载体有效菌体释放率。有效菌體释放率=载体中释放出的活菌数目/接种菌数。

1.2.5  不同接种量对菌剂中木霉菌生长数量的影响。

将Tr35发酵液分别稀释至1×107、1×106、1×105、1×104孢子/mL，按“1.2.3”结果分别接种于10 g灭菌的玉米秸秆粉中，置于28 ℃恒温培养箱中培养10 d，每个浓度重复3次。取1 g培养好的玉米秸秆粉置于含有100 mL无菌水的锥形瓶中，200 r/min充分混匀2 h后，用纱布过滤，显微镜下计数孢子量。

1.2.6  木霉菌剂及木霉微生物菌肥的制备及对玉米促生作用评价。

称取玉米秸秆粉100 g于灭菌袋中，灭菌锅121 ℃灭菌20 min。将灭菌后的玉米秸秆粉置于无菌操作台上冷却后，加入1×105孢子/mL的发酵液150 mL混合均匀。置于28 ℃恒温培养箱中培养7～10 d，得到木霉菌剂。

将无菌土与木霉菌剂按3∶1、4∶1、5∶1混合后种植玉米，每盆播入5粒玉米种子，每个处理重复4次，20 d后调查各处理的株高、鲜重、根长，评价不同含量的木霉菌剂对玉米植株生长的影响，筛选无菌土与木霉菌剂的最优配比。

将无菌土与腐熟的鸡粪和羊粪分别按6∶1、7∶1和8∶1的比例混匀后种植玉米，每盆播入5粒玉米种子，每个处理重复4次，20 d后调查各处理的株高、鲜重、根长，评价不同含量的有机肥对玉米植株生长的影响。

按照上述方法制备木霉菌剂，

将土与菌剂按5∶1混合制成菌剂土，制得的菌剂土分别与腐熟的鸡粪和羊粪按6∶1、7∶1和8∶1的比例混合均匀，得到简易木霉有机肥。每盆播入5粒玉米种子，每个处理重复4次，20 d后调查各处理的株高、鲜重、根长，评价不同含量的木霉有机肥对玉米植株生长的影响，筛选木霉菌剂与有机肥的最优配比。

木霉微生物菌肥的制备：向制备的木霉菌剂中分别加入0.9倍的腐熟羊粪和0.8倍的腐熟鸡粪及适量复合肥，混匀后分别得到木霉微生物菌肥（羊粪）和木霉微生物菌肥（鸡粪）。

1.2.7  对玉米茎腐病的防治效果。

禾谷镰孢菌玉米粒接种物的制备：将禾谷镰孢菌在PDA平板上培养5 d，取边缘菌丝，接种于150 mL液体产孢培养基中，于28 ℃、180 r/min 振荡培养 3～5 d 后适量稀释备用。将玉米粒清洗浸泡12 h，分装灭菌冷却后，按1.5%（v/w）比例将禾谷镰孢菌液接种于玉米粒培养基中，28 ℃，黑暗培养10 d，即为禾谷镰孢菌玉米粒接种物。

将土121 ℃湿热灭菌2 h冷却后，与木霉菌剂或微生物菌肥5∶1的比例混合均匀。挑选大小一致、健康的郑单958种子，75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸钠消毒10 min，无菌水洗涤3次晾干后备用。花盆中先放入木霉菌剂土或木霉微生物菌肥土，接着在每盆中分别放入禾谷镰孢菌玉米粒接种物30～40 g，然后覆盖3 cm的木霉菌剂土或木霉微生物菌肥土，再播入5粒灭菌的玉米，最后覆土。20 d后调查各处理发病级别，计算防治效果。

苗期茎腐病分级标准［11］：0级，整株生长正常，无病级；1级，玉米地上部地下部生长基本正常，病斑面积占根表总面积1/4以下，根群颜色白中有褐；2级，地上地下生长明显受阻，叶色变淡，株高仅为对照的3/4，侧根少而短，无须根，病斑连片，病斑面积占根表总面积的1/4～1/2，根群颜色白、褐相当；3级，地上地下部生长极不正常，地上部可见青枯、黄枯状，株高仅为对照的1/2，侧根极小，病斑占根表总面积1/2～3/4，根群颜色褐中带白； 4级，发芽但不出苗，几乎窒息而死，病斑占根表总面积3/4 以上，根褐色。

病情指数及防效的计算方法：

病情指数=∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100

防治效果=（空白对照病情指数-处理病情指数）/空白对照病情指数×100%

2  结果与分析

2.1  载体对木霉菌株Tr35的毒性分析

9种供试载体对木霉菌株Tr35的毒性分析见图1，只有腐殖酸对Tr35有抑制作用，其他8种载体对Tr35均没有抑制作用，具有作为菌肥载体的潜力。

2.2  载体的吸水率

9种供试载体的吸水率见图2，玉米秸秆粉的吸水率最高，达150.00%，其次为生物炭和泥炭，吸水率分别为135.00%和109.67%。鸡粪的吸水率最低，为12.67%。

2.3  载体中木霉菌株Tr35的释放率

9种载体对木霉菌株Tr35的释放率见图3，玉米秸秆粉的释放率最大，达172.78%，其次为羊粪和鸡粪，对Tr35的释放率分别为87.5%和83.33%。

2.4  不同接种量对菌剂中木霉菌生长数量的影响

Tr35不同接种量对菌剂中木霉菌生长数量的影响见图4，其中接种量为1×105孢子/mL时，菌肥中木霉菌的数量最多，达4亿孢子/g。

2.5  木霉菌剂效果评价  经检测，菌剂中的有效活菌数高于2×108个/g，符合我国制定的农业行业规定。

木霉菌剂不同施用量对玉米促生结果见表1，3个施用比例的株高和鲜重均高于对照，其中土∶菌剂为5∶1时，株高、根长和鲜重均最大，除根长外，均與对照差异显著。其中，株高增长15.14%，根长增长29.66%，鲜重增长30.51%。3个施用比例对玉米苗期茎腐病都有一定的防治效果，其中土：菌剂为5∶1时，防效最高，达51.77%。因此，将土∶菌剂为 5∶1混合制成菌剂土用于后续试验。

2.6  木霉有机肥效果评价

2.6.1  单独施用有机肥对玉米的促生效果。

单独施用有机肥对玉米的促生效果见表2。由表2可知，各处理的株高、根长与鲜重均高于对照，其中无菌土∶羊粪为 8∶1处理的株高和鲜重分别较对照增加41.52%和77.43%；无菌土∶羊粪为7∶1处理的

株高和鲜重分别较对照增加37.81%和57.68%。无菌土∶鸡粪为7∶1和6∶1时的鲜重与对照差异显著，分别较对照增加123.82%和99.69%。

2.6.2  不同木霉有机肥对玉米的促生效果。

将土换成菌剂土后，各处理对玉米的促生作用均有所改变，结果见表2。由表2可知，所有处理的株高和鲜重均高于对照，当菌剂土∶羊粪为7∶1时，其株高、根长和鲜重分别较对照增加55.74%、4.93%和67.28%，较单独施用羊粪的效果好。当菌剂土与鸡粪8∶1配施时，其株高和鲜重分别较对照提高了50.56%和92.66%。当菌剂土∶鸡粪为7∶1时，其株高、根长和鲜重分别较对照增加47.68%、25.07%和58.72%。当菌剂土∶羊粪为6∶1时，其株高和鲜重分别较对照增加了41.60%和39.14%。

综合分析，菌剂土与羊粪7∶1的促生效果最好，优于单独施用有机肥和菌剂。其次当菌剂土∶鸡粪为8∶1和7∶1，菌剂土∶羊粪为6∶1时，对玉米生长也有较好的促进作用。

2.6.3  不同微生物菌肥对玉米苗期茎腐病的防治效果。

木霉微生物菌肥（羊粪）和木霉微生物菌肥（鸡粪）对玉米茎腐病有一定的防治效果，防效分别为61.31%和54.97%。

3  结论与讨论

该研究通过筛选载体，得到具有吸水性强、对Tr35无毒和高释放率的玉米秸秆粉，其与Tr35共同发酵制备木霉菌剂，当土与菌剂为5∶1时，促生效果明显，并对玉米苗期茎腐病防效达51.77%。菌剂土与腐熟羊粪为7∶1时的木霉有机肥促生效果最好，以此比例制备木霉微生物菌肥，对玉米苗期茎腐病防效达61.31%。这2种肥料可根据不同地理环境进行施用，当土壤养分含量较高时可选用木霉菌剂，当养分含量较低时可选择木霉微生物菌肥，达到节本增效的目的。

微生物肥料中的载体是保证微生物存活免受外界不利因素影响的一类材料［12］，且能够使微生物利用载体中的养分迅速繁殖。载体的选择是影响菌肥效果的重要影响因素［13］。Ben Rebah等［14］研究表明，高有机质含量、最佳氮含量、呈中性的酸碱度、高持水能力、对吸附其中的功能微生物生长无抑制作用等因素是优秀载体需具备的性质。玉米秸秆主要由纤维素类物质、可溶性糖类、粗蛋白质、粗脂肪和少量的无机盐及水组成［15］。玉米秸秆中除含有绝大部分的 C元素外，还含有 K、Si、N、Mg、P、Cl等元素［16］，是生产木霉菌较好的原料［17］。该研究玉米秸秆对木霉菌Tr35生长没有影响，吸水能力强，在确保Tr35在载体上正常生存的同时，具有较高的释放率，所以选用玉米秸秆作为生物菌肥的载体。

微生物菌肥中的有益微生物在改土和促生方面具有积极效应，可显著增强植物的抗逆性［18］。木霉是一种广泛存在于土壤中的生防微生物，不仅可以用来防治病害，而且能促进植物的生长发育。该研究以非洲哈茨木霉为主要成分研制木霉菌剂，不仅对玉米生长有促生作用，同时对玉米茎腐病有较好的防治效果，最高防效为51.77%。研究指出，非洲哈茨木霉可以通过接触、缠绕、消解［19］、重寄生［20］、产生挥发性物质［21］等方式达到抑制病原菌的目的，也可以通过产生细胞壁降解酶（β-1，3-葡聚糖酶、纤维素酶等）进而破坏病原菌的细胞壁，使其停止生长或侵染［22］，不同木霉菌也会表现出种内、种间的差异性，防治机理也存在不同，该研究所选非洲哈茨木霉菌株Tr35的作用机制还有待研究。

畜禽粪有机肥含有大量有机质及作物生长所需的各类营养元素，不仅有利于作物生长、增加作物产量、改善农产品品质［23］，还可以改善土壤的物理性状、增加土壤中的有机质和养分含量、提高土壤保水保肥能力，能降低土壤容重并提高微生物数量［24-25］。羊粪中有机质、氮、磷含量高，不仅是一种优质的土壤改良剂更是一种丰厚的有机肥［26］。鸡因为其消化道短的特殊生理结构，鸡粪中含有40%～70% 未被吸收代謝的有机质和氮素等［27-28］，也是腐熟有机肥的优质原料。该研究在木霉菌剂的基础上，加入有机肥，制备木霉微生物菌肥，当菌剂土与羊粪7∶1时，对玉米的促生效果明显，显著高于单独施用羊粪的处理，同时对玉米茎腐病的防效也达60%以上。

参考文献

［1］ 郭成，王宝宝，杨洋，等.玉米茎腐病研究进展［J］.植物遗传资源学报，2019，20（5）：1118-1128.

［2］ 杨洋，陈国康，郭成，等.玉米种质资源抗腐霉茎腐病鉴定［J］.作物学报，2018，44（8）：1256-1260.

［3］ 陈捷，宋佐衡，梁知洁，等.玉米茎腐病生物防治初步研究［J］.植物保护，1994，20（3）：6-8.

［4］ HARMAN G E，HOWELL C R，VITERBO A，et al.Trichoderma species-opportunistic，avirulent plant symbionts［J］.Nature reviews microbiology，2004，2（1）：43-56.

［5］ 吴海燕，孙淑荣，范作伟，等.玉米茎腐病生物防治技术研究［J］.吉林农业科学，2006，31（4）：45-47.

［6］ 余嘉，姚丽美，陈捷.防治玉米茎腐病的一种新型木霉菌复合种衣剂（英文）［J］.上海交通大学学报（农业科学版），2015，33（6）：23-29.

［7］ 吴晓儒，陈硕闻，杨玉红，等.木霉菌颗粒剂对玉米茎腐病防治的应用［J］.植物保护学报，2015，42（6）：1030-1035.

［8］ LU Z X，TU G P，ZHANG T，et al.Screening of antagonistic Trichoderma strains and their application for controlling stalk rot in maize［J］.Journal of integrative agriculture，2020，19（1）：145-152.

［9］ 王振.有机添加物与生防菌对番茄根结线虫病的协同控制［D］.北京：中国农业科学院，2014.

［10］ 吴红淼，林文雄.药用植物连作障碍研究评述和发展透视［J］.中国生态农业学报，2020，28（6）：775-793.

［11］ 晋齐鸣， 卢宗志， 潘顺法， 等.玉米茎腐病病原对玉米苗期致病性研究［J］.玉米科学， 1994， 2（1）：73-75.

［12］ 韩华雯.几种新型植物根际促生菌肥载体筛选及研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2013.

［13］ 李永兴，匡柏健，李久蒂.不同载体对微生物菌剂质量的影响［J］.土壤肥料，1999（6）：25-27.

［14］ BEN REBAH F，TYAGI R D，PRVOST D.Wastewater sludge as a substrate for growth and carrier for rhizobia：The effect of storage conditions on survival of Sinorhizobium meliloti［J］.Bioresource technology，2002，83（2）：145-151.

［15］ 吕耀军，仇阳，杨秋菊，等.玉米秸秆能源化利用分析［J］.能源与节能，2023（4）：34-37.

［16］ 刘丽莉.秸秆综合利用技术［M］.北京：化学工业出版社，2017.

［17］ 田连生，李书生，史延茂，等.利用玉米秸秆制备生物杀菌剂的研究［J］.中国生态农业学报，2005，13（2）：59-61.

［18］ 宋以玲，于建，陈士更，等.复合微生物菌剂对棉花生理特性及根际土壤微生物和化学性质的影响［J］.土壤，2019，51（3）：477-487.

［19］ 田淼，彭玉飞，吕红，等.非洲哈茨木霉 LMNS-M9的鉴定、生物学特性及其对藜麦的促生作用［J］.微生物學通报，2023，50（9）：3848-3865.

［20］ WU X Q，LYU Y P，REN H，et al.Degradation of oxalic acid by Trichoderma afroharzianum and its correlation with cell wall degrading enzymes in antagonizing Botrytis cinerea［J］.Journal of applied microbiology，2022，133（5）：2680-2693.

［21］ KHRUENGSAI S，PRIPDEEVECH P，D′SOUZA P E，et al.Biofumigation activities of volatile compounds from two Trichoderma afroharzianum strains against Fusarium infections in fresh chilies［J］.Journal of the science of food and agriculture，2021，101（14）：5861-5871.

［22］ XUE M，WANG R，ZHANG C Y，et al.Screening and identification of Trichoderma strains isolated from natural habitats in China with potential agricultural applications［J］.BioMed research international，2021，2021：1-13.

［23］ 刘莉.有机肥替代化肥决策机制及效果研究［D］.北京：中国农业科学院，2020.

［24］ 王亚艺，蔡晓剑，李松龄.有机肥与无机肥配施对作物产量和土壤养分含量的影响［J］.湖北农业科学，2015，54（8）：1813-1815.

［25］ 杜永所，石海鹏，刘爱巧，等.鸡粪有机肥对蟠桃品质及土壤理化性质的影响［J］.安徽农业科学，2023，51（22）：158-162.

［26］ RICH N，BHARTI A，KUMAR S.Effect of bulking agents and cow dung as inoculant on vegetable waste compost quality［J］.Bioresource technology，2018，252：83-90.

［27］ 李书田，刘荣乐，陕红.我国主要畜禽粪便养分含量及变化分析［J］.农业环境科学学报，2009，28（1）：179-184.

［28］ 马若男，李丹阳，亓传仁，等.碳氮比对鸡粪堆肥腐熟度和臭气排放的影响［J］.农业工程学报，2020，36（24）：194-202.