外泌体在炎症性皮肤疾病中的作用研究进展

邓皓月 黎静宜

四川大学华西医院皮肤性病科,四川成都,610041

皮肤是人体最大的器官,总面积约2平方米,约占人体总质量的15%,由外向内依次由表皮、真皮和皮下组织构成,具有免疫、屏障、感觉、代谢、体温调节等生理功能[1]。皮肤在遗传易感性、免疫失调、环境变化、病原微生物侵袭等多因素影响下,出现病理改变,引发结构或功能障碍,发展为荨麻疹(urticaria)、特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)、银屑病(psoriasis)等不同炎症性皮肤疾病。例如皮肤屏障损伤是AD发病的关键因素之一[2],神经酰胺减少和丝聚蛋白基因突变等因素可以导致表皮结构和功能异常,最终引发AD[3,4];免疫系统激活是银屑病发病的核心机制,Th1和Th17细胞分化增殖出现异常,相关细胞因子促进角质形成细胞增殖、血管生成和炎症浸润,推动银屑病样皮损发展[5];目前认为荨麻疹发作主要与免疫紊乱密切相关,肥大细胞活化后释放以组胺为代表的炎症介质,导致瘙痒和风团,还可以诱导嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等其他免疫细胞浸润,共同影响荨麻疹发病[6]。炎症性皮肤疾病严重影响患者的身心健康和生活质量,进一步探索其发病机制和高效治疗手段具有重要意义,关于炎症性皮肤疾病免疫激活和调控机制仍在深入研究之中。

外泌体是在生理或病理状态下由各种细胞分泌的包含脂质、核酸、蛋白质等活性物质的细胞外囊泡,不仅具有参与细胞分化迁移、介导细胞间通讯、调节免疫应答、组织修复等生物学功能,还与肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等机体病理状态密切相关[7]。近年来,外泌体在炎症性皮肤疾病中的作用正得到逐步探索,外泌体可能在皮肤免疫系统活化或者抑制中发挥调控作用。本文就外泌体和相关炎症性皮肤疾病的关系做一综述,希望对炎症性皮肤疾病的诊断及治疗提供新思路。

1 外泌体

1.1 外泌体的来源与结构 外泌体最早于体外培养的绵羊网织红细胞上清液中发现[8],它是一种直径通常在30～150 nm的细胞外囊泡,可由淋巴细胞、肥大细胞、巨噬细胞、内皮细胞、血小板等几乎所有类型的细胞分泌产生,并广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液、乳汁、泪液等体液中[9]。

外泌体通过内体途径生成[10],主要过程包括:(1)细胞膜内陷形成早期内体,相关生物活性物质开始在其中积累;(2)在相关蛋白的控制下,早期内体变成晚期内体;(3)晚期内体的界膜多处凹陷,向内出芽形成管腔状囊泡,从而转变为多泡体;(4)多泡体与细胞膜融合,管腔状囊泡再次凹陷,以内出芽方式形成颗粒状小囊泡,胞内物质最终以囊泡的形式释放到体外,即形成外泌体。

外泌体是具有纳米级脂质体结构的胞外双囊泡,含有核酸、脂质、蛋白质、细胞因子等生物活性物质。外泌体包含多种核酸,如DNA、mRNA、miRNA、siRNA、circRNA等[11]。外泌体有丰富的脂质组分,其组成通常与脂质双分子层结构一致,包括胆固醇、鞘脂、磷酸肌醇、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷酸肌醇激酶、磷脂酰丝氨酸、三酰甘油等[12]。不同来源的外泌体所含蛋白质是有差异的,常用外泌体标记蛋白包括生物发生相关蛋白(如Alix、TSG101)、跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81)、热休克蛋白(如HSP 70、HSP90)、膜转运和融合相关蛋白(如Rab,GTPases)、钙磷脂结合蛋白、脂筏标记蛋白等[13]。

1.2 外泌体与疾病相关性 外泌体与许多疾病的发生发展具有相关性,在疾病诊断与治疗方面具有重要潜力。外泌体是一种新型细胞间通讯机制,外泌体表面跨膜配体可直接与受体细胞表面受体结合,触发信号传导,激活受体细胞;外泌体也可以与质膜融合或被内化吸收,将生物活性物质释放到受体细胞的胞质中,影响其生物学活性,调节机体生理或病理状态[14]。外泌体在大小、内容物等方面具有异质性,可以通过测定相应体液中外泌体含量及其特异性蛋白质、核酸等组分,分析供体细胞功能状态,由此评估不同疾病中外泌体的生物学功能[15]。外泌体因其介导细胞通讯的功能和异质性的特点,有望成为非侵入性疾病诊断生物标志物。

外泌体在疾病治疗上也开辟了新途径。由于外泌体存在广泛,且易获取,同时具备纳米级脂质体结构、高生物相容性、高血脑屏障穿透性、高循环稳定性和低毒性等特点,可作为天然药物分子载体进行靶向药物输送[16],具有巨大治疗前景。例如外泌体可装载姜黄素、紫杉醇、甲氨蝶呤等化疗药物,直接靶向肿瘤细胞,进一步提高药物利用率、降低药物毒性和减少耐药,提升肿瘤治疗效率[17],在中枢神经系统疾病中,外泌体载药系统可以穿透血脑屏障,提高药物浓度和延长作用时间,实现脑内安全高效给药[18]。

外泌体异常分泌参与疾病进展,但相关调控机制尚未完全明确。Wu等[19]在体外模拟细胞外基质的硬化过程,发现硬化细胞外基质可通过Akt信号通路,磷酸化并激活鸟嘌呤核苷酸交换因子Rabin8,进一步活化Rab8蛋白,使外泌体分泌增多,影响肿瘤微环境,促进肝癌细胞生长和转移。Yang等[20]发现与肿瘤发生密切相关的长链非编码RNA(lncRNA HOTAIR)通过调节Rab35在多泡体处的定位,并上调Rab35表达,促进多泡体向质膜运动;HOTAIR促进VAMP3与SNAP23的共定位,诱导SNARE复合物形成,介导多泡体与质膜进一步融合,从而控制外泌体释放。有研究[21]发现在缺氧条件下,卵巢癌细胞通过STAT3通路调节Rab7和Rab27a蛋白,促进外泌体释放,增强肿瘤侵袭性。上述研究提示Rab蛋白家族是影响外泌体分泌的重要调控因子。

2 外泌体与特应性皮炎

特应性皮炎是一种易反复发作的慢性炎症性皮肤病,以皮肤干燥、瘙痒和湿疹样皮损为典型表现。AD发病率在全球范围内不断增高,各年龄段均可发病[22]。AD发病机制尚未完全明确,可能与遗传易感性、Th2型炎症反应、皮肤屏障功能障碍、环境变化等因素有关[23],近期研究[24,25,26,27,28]表明外泌体可能参与AD发病,并具有治疗AD皮肤炎症的潜在价值。

Zhu等[24]提取AD患儿和健康对照组的血浆来源外泌体,将不同浓度的AD患儿外泌体与角质形成细胞(keratinocyte,KC)共培养后发现各组KC增殖率降低、凋亡率升高,以20 g/L外泌体组变化最显著;进一步检测发现20 g/L外泌体组刺激KC后表达的角蛋白K6(KC活化标记物)、K10(KC分化标记物),以及胸腺基质淋巴生成素(TSLP)、IL-33水平明显高于对照组。韩悦等[25]将不同浓度健康人外泌体与KC共培养,较空白对照组,KC增殖水平明显降低和凋亡水平明显增高,并确定40 g/L为最佳蛋白浓度;与其余对照组相比,AD组外泌体与KC共培养后,发现K16(KC活化标记物)、K10、IVL(KC分化标记物)、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL2表达上调。KC是表皮中数量最多的细胞,也是建立表皮屏障和免疫稳态的关键细胞,当KC出现活化、增殖、分化等异常,可促发免疫反应,炎症因子分泌增加,加剧皮肤炎症损伤[29]。上述研究提示外泌体可能通过调控KC的活化、分化、增殖、凋亡和相关炎性细胞因子分泌,破坏表皮屏障,引发免疫反应,参与AD发病。

Wang等[26]发现与对照组相比,经间充质干细胞来源外泌体(MSC-ex)治疗的AD小鼠模型皮损愈合更快,治疗后皮损组织病理示表皮厚度恢复正常、淋巴细胞浸润减少、真皮血管增生等表现;MSC-ex抑制外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)增殖,促进PBMC向调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)分化,Treg细胞比例增加。Treg细胞是维持AD患者免疫稳态的重要细胞之一,研究[30]发现AD患者外周血Treg细胞比例降低,提高Treg细胞水平可抑制效应T细胞异常活化、维持自身免疫耐受、控制炎症反应等,最终控制AD发病。MSC-ex可以通过提高Treg细胞比例调节免疫平衡、减轻AD皮损炎症细胞浸润、修复表皮和真皮等方式加速皮损愈合。

Cho等[27]对AD小鼠模型注射人脂肪间充质干细胞来源外泌体(ASC-exosomes),治疗后小鼠皮损肥大细胞浸润减少,血清IgE水平和嗜酸性粒细胞数量明显降低,以及IL-4、IL-31、IL-23和TNF-α水平下调。Shin等[28]同样研究证实ASC-exosome治疗能显著改善小鼠的AD样皮损,降低皮肤IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α、TSLP等炎症介质水平;脂质定量分析发现治疗后小鼠表皮神经酰胺含量显著增加。神经酰胺是角质层主要脂质成分之一,可维护表皮脂质结构和渗透屏障功能,AD患者表皮神经酰胺含量降低,角质层脂质成分失调,引起表皮渗透屏障功能损伤[31]。ASC-exosome不仅通过降低细胞因子分泌来抑制皮肤炎症,还通过调节皮肤脂质代谢,促进神经酰胺产生来修复屏障,以此提供了一种无细胞治疗AD的新手段。

3 外泌体与银屑病

银屑病是一种以红斑、斑块、鳞屑,伴瘙痒为特征的慢性、终身性、炎症性皮肤病,包括寻常型银屑病、红皮病型银屑病、脓疱型银屑病、关节病型银屑病等多种类型,全球超1亿人患病[32]。皮肤创伤、感染、紫外线、精神压力、高脂血症、高血压等因素均可能影响银屑病的发生发展,遗传易感性和自身免疫紊乱是银屑病的主要病因[33,34]。角质形成细胞异常分化增殖以及免疫细胞浸润是银屑病的典型特征[35],研究[36,37]发现外泌体可能通过介导角质形成细胞与免疫细胞间通讯参与银屑病发病。

Jiang等[36]通过IL-17、IL-22等银屑病相关因子处理角质形成细胞,从中提取外泌体,发现角质形成细胞外泌体可以显著诱导中性粒细胞发生炎性细胞死亡(NETosis),还通过NF-kB和p38 MAPK信号通路促进中性粒细胞增殖活化,使IL-6、IL-8和TNF-a的表达水平增高;在银屑病小鼠模型中予以外泌体分泌抑制剂GW4869后发现皮损中角质形成细胞增殖减少、中性粒细胞浸润降低,而皮下注射角质形成细胞外泌体后,小鼠皮损炎症程度加重。Shao等[37]发现泛发性脓疱型银屑病患者中性粒细胞外泌体能激活MAPK和NF-kB通路,诱导角质形成细胞高表达IL-1β、IL-18、IL-36G、TNF-a等介质,而经过GW4869处理过的中性粒细胞上清液则不能诱导角质形成细胞高表达上述因子;角质形成细胞在外泌体的刺激下分泌趋化因子,进一步诱导中性粒细胞迁移,加强皮肤炎症浸润。中性粒细胞与角质形成细胞都是参与银屑病发病的关键细胞,在各种损伤刺激下,角质形成细胞释放趋化因子,诱导中性粒细胞由血液循环聚集至皮肤炎症部位,进一步产生活性氧物质、脱颗粒和形成中性粒细胞胞外陷阱(Nets),上述过程可造成生物大分子、细胞等出现氧化损伤,引起炎症介质分泌,反之促进角质形成细胞增殖和血管增生,加剧皮肤炎症反应[38]。上述研究提示外泌体在角质形成细胞和中性粒细胞之间传递信息,使两者相互作用,破坏皮肤免疫失调,引起银屑病皮损。

Zhang等[39]通过人脐带间充质干细胞外泌体(hucMSCs-Exo)治疗银屑病小鼠模型,小鼠皮损严重程度和炎症浸润程度均低于对照组,并抑制皮损中IL-17、IL-23和CCL20表达;将hucMSCs-Exo与树突状细胞共培养,发现外泌体可抑制树突状细胞的成熟、活化以及降低IL-23产生。Zhang等[40]在银屑病小鼠模型中予以MSC-ex治疗后,外泌体组小鼠皮肤中IL-17和IL-23的含量较对照组降低。有研究[41]用表达细胞因子信号抑制因子(Suppressor of cytokine signaling1,SOCS1)的重组腺病毒感染树突状细胞,从中分离外泌体,与咪喹莫特组小鼠相比,咪喹莫特+外泌体治疗组小鼠皮肤红斑、鳞屑明显更少,组织病理显示真皮淋巴细胞浸润减少,皮损中IL-17A和IL-23表达降低,治疗机制可能与外泌体中SOCS1蛋白通过JAK/STAT信号通路抑制Th17细胞分化,减少IL-17A分泌有关。IL-17/IL-23轴在银屑病发病机制中发挥作用,也是治疗的关键靶点,银屑病患者皮损显著高表达IL-23,树突状细胞是IL-23的主要来源之一,IL-23可促进Th17细胞分化增殖,产生IL-17、IL-22等细胞因子,进一步作用于角质形成细胞、成纤维细胞等靶细胞,诱导其他炎症因子产生,共同加重银屑病样皮肤病变[42]。外泌体可能通过抑制IL-17和IL-23的产生发挥免疫调节作用。

4 外泌体与口腔扁平苔藓

扁平苔藓(lichen planus,LP)是一种原因复杂的自身免疫性、炎症性皮肤病,可累及全身各处皮肤、黏膜或指/趾甲,临床以紫红色多角形扁平丘疹伴瘙痒为典型皮肤表现,其中口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)影响0.5%～1.5%人口,以颊黏膜Wickham纹为特征性表现,具有潜在恶性转化或感染可能[43]。LP发病机制由T细胞、NK细胞、树突状细胞、角质形成细胞等多种细胞参与,以细胞毒性T细胞为主要介导细胞[44]。

Yang等[45]发现OLP患者T细胞来源外泌体(T-exos)中IL-7、IL-10、IL-12、IL-17的表达水平明显增高,经T-exos处理的角质形成细胞凋亡率提高,并出现细胞大小不均、胞质空泡化、细胞碎片增多等形态改变。T细胞可能通过释放外泌体,提高炎症介质水平来介导OLP免疫反应;外泌体中TNF-α可能与角质形成细胞表面受体结合,激活caspase级联反应导致口腔角质形成细胞凋亡。Peng等[46]将OLP患者血浆来源外泌体与T细胞共培养,发现外泌体可以促进T细胞增殖、迁移并抑制其凋亡,检测发现上清液中IFN-γ水平增高,外泌体可能通过调节T细胞介导的免疫反应来参与OLP发病。有研究[47]同样发现T-exos不仅上调T细胞IL-10、IL-17表达,还可促进巨噬细胞、中性粒细胞等其他免疫细胞分泌巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α/β,MIP-1α/β进一步与T细胞表面受体CCR1/5结合,诱导外周T细胞迁移至病变部位,加重OLP口腔黏膜淋巴细胞浸润。外泌体可能通过作用于淋巴细胞、角质形成细胞等免疫细胞,以上调炎症介质表达或调控细胞生物功能的方式参与OLP发病。

5 外泌体与大疱性类天疱疮

大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid,BP)是一种常见的自身免疫性疱病,以躯干、四肢红斑基础上的紧张性大疱或水疱伴明显瘙痒为典型表现,黏膜较少受累,通常影响老年人[48]。高龄、神经和精神系统疾病、药物(如利尿剂、抗生素、镇痛药、降糖药等)、其他皮肤疾病(如扁平苔藓、银屑病等)等可能是BP的危险因素[49]。BP的组织病理特点是表皮下水疱,伴有真皮内大量炎症细胞浸润,其病变主要是由存在于皮肤基底膜带半桥粒中的致病性抗原BP230、BP180与自身抗体结合而引起,抗原抗体结合后激活补体系统,使肥大细胞、中性粒细胞等活化、脱颗粒,释放金属蛋白酶、弹性蛋白酶、趋化因子等物质,导致表皮、真皮分离,形成表皮下水疱[50]。

为探索BP患者水疱液加重皮肤损伤的机制,Fang等[51]从BP患者水疱液中提取外泌体,发现外泌体可能通过激活ERK1/2和STAT3信号通路使角质形成细胞产生IL-6、TNF-α和CXCL8,CXCL8发挥趋化作用促使中性粒细胞迁移至皮损部位;外泌体质谱分析没有发现BP180或BP230,但检测到外泌体中含有少量抗体片段和补体成分。外泌体可能通过上调炎症介质表达和诱导炎症细胞浸润,加剧BP皮损。

6 外泌体与荨麻疹

荨麻疹是一种临床常见的过敏性、炎症性皮肤疾病,以风团和不同程度瘙痒为特征,伴或不伴血管性水肿,皮损易反复发作,通常在24小时内消退。荨麻疹发病机制非常复杂,肥大细胞是关键效应细胞,各种原因引起肥大细胞活化、脱颗粒,释放组胺、细胞因子、趋化因子等一系列炎症介质,引起血管通透性增加、平滑肌收缩和腺体分泌增加,从而引发风团。对于引发肥大细胞活化脱颗粒的机制未完全明确,现有研究[52]提出IgE、抗IgE的IgG自身抗体、补体(如C3a、C5a等)、前列腺素、蛋白酶、神经肽等物质可通过作用于肥大细胞表面受体,诱导肥大细胞脱颗粒参与发病。

为进一步探索引起肥大细胞活化的因素,Fang等[53]从慢性自发性荨麻疹(chronic spontaneous urticaria,CSU)患者和健康志愿者的血浆中提取外泌体,体外刺激人肥大细胞株HMC-1,发现HMC-1脱颗粒,释放组胺、细胞因子(包括IL6、TNFα、IL4)、类胰蛋白酶、趋化因子(包括CXCL1、CXCL5、CCL-2)、血管内皮生长因子等多种介质,且抗组胺治疗无效患者所释放的介质水平明显高于抗组胺治疗有效患者和健康对照;外泌体提高HMC-1表面Toll样受体(TLR)2/4表达和MAPK磷酸化,考虑外泌体通过激活TLR2、TLR4和MAPK通路诱导肥大细胞活化,抗组胺治疗无效患者可能存在其他机制使组胺分泌量显著增高而加重病情。

7 小结

综上所述,不同细胞来源的外泌体参与特应性皮炎、银屑病、口腔扁平苔藓、大疱性类天疱疮、荨麻疹等炎症性皮肤疾病的发生发展。外泌体通过调节细胞分化、增殖、活化、凋亡等生物学过程,影响皮肤正常生理功能,使其发生病理改变;通过激活信号通路,增加炎症介质表达,促发皮肤炎症反应;通过介导细胞间通讯,上调趋化因子诱导免疫细胞迁移,加剧皮损炎症浸润;还可作为减轻炎症损伤、抑制皮肤炎症进展的新型治疗方式。对于外泌体中不同生物活性物质在炎症性皮肤疾病中的作用以及外泌体的具体调控机制还需要进一步研究,以早日明确外泌体在炎症性皮肤疾病诊断和治疗上的价值。