ESBLs阳性肺炎克雷伯菌的研究进展

丁嘉雯 李娜

滨州医学院附属医院检验科，滨州 256600

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是目前临床上重要的条件致病菌之一［1］。它在自然界中广泛存在，不仅可以在水和土壤中单独存在，还可以与植物、昆虫或各种哺乳动物等以共生生物或潜在病原体的形式共同存在，引起人类广泛感染。20世纪80年代，一名德国医生首次发现了超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）基因；他在1例ICU患者身上分离出了具有超广谱活性的β-内酰胺酶基因SHV-2［2］。研究者分析发现，SHV-2是SHV-1在氨基酸序列的238位点由甘氨酸序列突变成了丝氨酸序列，发生了点突变。近年来，随着广谱抗菌药物的大量应用，导致KPN引起的耐药性及医院感染的比例明显上升。因为产ESBLs KPN经常携带不止一种耐药基因，所以引起的细菌感染往往表现为更强的耐药性。因此，对KPN的深入研究具有重要意义［3］。

ESBLs阳性KPN的耐药基因分析

1.检测β-内酰胺类［TEM、SHV、OXA、CTX-M］、喹诺酮类［aac（6’）-Ib-cr］的耐药基因

KPN最常见的耐药机制是产ESBLs，可水解青霉素及头孢菌素类抗生素，造成多药耐药，而ESBLs是β-内酰胺酶中重要的一类，它主要是质粒介导的衍生物，通过改变活性位点构型的突变而产生，从而扩大酶的水解谱［4］。目前，发现的ESBLs依据其结构和功能主要包括TEM、SHV、邻氯青霉素水解酶（OXA）、CTX-M和其他一些少见类别［5］。根据CTX-M型ESBLs氨基酸残基序列相似性，将其大致分为4类：CTX-M-1型（CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-15及CTX-M-55等）、CTX-M-2型（CTX-M-2、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-6等）、CTX-M-9型（CTX-M-9、CTX-M-13、CTX-M-14、CTX-M-27等）及CTX-M-8/CTX-M-25组［6］。此外，ESBLs的流行类型在不同的国家和地区也不尽相同，这是抗菌药物的使用观念和使用策略不同以及细菌对于不同抗菌药物的自身选择压力不同导致的［7］。有研究显示，北美及西欧地区主要以TEM型和SHV型为主，南美地区和东欧地区则以CTX-M型为主［8］。而在我国，CTX-M型是主要的耐药基因，同时还兼有SHV型和TEM型的存在。

CTX-M是我国最常见的ESBLs耐药基因。有研究表明，染色体DNA上β-内酰胺类CTX-M-9耐药基因在ESBLs（+）的KPN中阳性率为70%，但在ESBLs（-）KPN中的检出率为0。其次，喹诺酮类aac（6’）-Ib-cr耐药基因在ESBLs（+）KPN中的检出率也明显高于ESBLs（-）的KPN菌株，其阳性率为40%［9］。因此，KPN染色体DNA所携带的β-内酰胺类CTX-M-9基因和喹诺酮类aac（6’）-Ib-cr等多种耐药基因均与产ESBLs的垂直遗传传播有关。

同时，由于抗生素的滥用导致细菌对于抗菌药物产生耐药，使得越来越多的产ESBLsKPN携带多种耐药基因，这让我们对其耐药基因的研究变得更加复杂也更加困难。

2.整合子

整合子是近年来新发现的可移动基因元件，是一种潜在的移动端遗传元件，能够捕获和传递特定的外源基因盒［10］。其本身无法移动，通常位于质粒、转座子和致病岛屿上，捕获并整合耐药基因从而形成巨大的多基因座，并随着细菌的不断复制进行传播，促进它们在不同细菌之间转移［11］。根据整合酶基因的核苷酸序列不同，现已经发现了5类整合子［12］，其中对I、Ⅱ、Ⅲ类整合子研究较多，且明确与耐药性有关。在革兰阴性菌株中，I类整合子更为常见，且有较高的耐药基因携带率，是KPN最常见的整合子类型。研究表明，ESBLs（+）KPN中，整合子的携带率较ESBLs（-）KPN高［13］，且其含有的ESBLs基因型别越多，该菌携带I类整合子的可能性也越大［14］。I类整合子已被鉴定为耐药基因的主要来源，并被怀疑是多种革兰阴性菌耐药基因的宿主和交换平台，因此了解KPN I类整合子的流行病学和分子特征对实施干预策略至关重要［15］。

多位点序列分型

首先参照多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）数据库确定MLST的7个管家基因（gapA、rpoB、mdh、pgi、phoE、infB、tonB）［16］。采用水煮法粗提DNA，将得到的聚合酶链式反应（PCR）模板进行扩增。PCR扩增在50 ℃的退火温度下进行，除了gapA（60 ℃）和tonB（45 ℃）以外。纯化的PCR产物用焦磷酸测序法进行测序［17］，并使用SnapGene对序列进行校对，用在线工具（https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）分配等位基因编号和序列类型。根据pubMLST得到的ST结果，将pubMLST数据库中相应ST类型的等位基因按相同顺序串联，得到不同ST类型的串联序列［18］。MLST的结果可以通过聚类技术进行分析，使用最严格定义的eBURST V3（http：//eburst.mlst.net）分析［19］；基于ST型，可以把不同菌株归于不同克隆群中，高遗产相似性的分离株归为一个克隆群［20］。

同源性分析

分子分型在流行病学研究中起着重要作用，可以确定分离株和感染源之间的遗传相似性，这种方法也可以用于监测医院病原体的传播和遗传多样性。KPN的同源性分析的方法有多种，如脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）［21］和质谱仪（MALDI-TOF MS）［22］。

1.PFGE

PFGE使用脉冲场电泳室分离限制性DNA条带，然后根据PFGE条带模式对细菌进行克隆分配。其结果具有极高的分辨率和再现性，因此被认为是流行病学研究的分子金标准［23］。它可以根据基因组指纹图谱的变化来区分临床和环境分离株，对亲缘相近菌株进行细致区分。PFGE分型用于感染控制，追踪医院内病原体的传播。比较从患者、医护人员和病房环境中分离的细菌PFGE条带，有助于感染控制团队确定感染源和传播途径［24］。

将筛选出的ESBLs阳性KPN菌株进行裂解、洗胶、酶切、上样，通过电泳获得图像，利用BioNumerics软件进行同源性分析［25］。用该软件分析宏观限制性片段模式，采用算术平均的非加权对组方法进行树状图分析。当菌株的宏观限制模式的3个条带的差异最大时（即相似性水平约为80%），菌株可被聚为群。采用皮尔逊双侧卡方检验，如果任何单元格中的期望计数低于要求，则使用Fisher精确检验来比较这些数据［26］。

2.MALDI-TOF MS

近10年来，MALDI-TOF MS作为一种快速、可靠的微生物鉴定方法得到了广泛的应用［27］。它的优势主要体现在通量高、时效高、误差小、性价比高等［28］，已被纳入许多临床微生物实验室的工作流程，在流行病学领域有较好的应用前景。这种方法的实施使实验室能够在以前无法想象的时间尺度上为临床医生提供最终的生物鉴定。MALDI-TOF MS主要检测的蛋白是核糖体蛋白，分析检测蛋白质指纹图谱，但也能检测到其他高度丰富的胞质蛋白（如DNA结合蛋白和冷休克蛋白）。然后使用软件将未知生物的光谱剖面与参考数据库进行比较，通过分析病原菌菌株间蛋白丰度的细小差异，自动确定被测试生物的身份［29］。

MALDI-TOF MS检测结果与MLST检测结果具有良好的相关性，可建立各医院流通的产ESBLs KPN克隆体的数据库，有利于疫情的快速识别［30］。但是，MALDI-TOF MS仍然存在许多挑战，包括参考谱的主要局限性。微生物的质谱鉴定依赖于鉴定每个物种的特征谱，并与MALDI-TOF MS中的大型数据库（也称为参考谱）进行比较。

综上所述，ESBLs阳性KPN由于其强大且复杂的耐药机制，给临床抗菌治疗带来了很大的困难，其暴发也对不同地区乃至国家的医疗卫生安全带来极大威胁。因此，明确其具体的耐药机制、分子分型及同源性，有助于科学制定抗感染治疗方案，对防止或减慢耐药基因、耐药菌株的产生、播散和流行具有重要意义［31］。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明丁嘉雯：试验实施与研究，数据采集与分析，文章撰写；李娜：设计并指导试验，数据分析，对文章的知识性内容作批评性审阅