怀菊花中1个新的没药烷型倍半萜

蔡雅君，薛金凤，赵慧君，支燕乐，卢纪衡，陈 辉，王彦志，冯卫生，薛贵民, 2

•化学成分•

怀菊花中1个新的没药烷型倍半萜

蔡雅君1，薛金凤1*，赵慧君3，支燕乐1，卢纪衡1，陈 辉1，王彦志1，冯卫生1，薛贵民1, 2*

1. 河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046 2. 豫药全产业链研发河南省协同创新中心河南省中药开发工程技术中心，河南 郑州 450046 3. 郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450046

研究怀菊花的化学成分。采用硅胶、ODS、Sephadex LH-20以及半制备HPLC等方法进行分离纯化，根据波谱数据并结合文献对化合物结构进行鉴定。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，以抑制炎性细胞因子一氧化氮（NO）的分泌为评价指标对分离得到的化合物进行体外抗炎活性评价。从怀菊花二氯甲烷提取物中分离得到7个化合物，分别为 (6, 7, 10)-没药烷-7-羟基-10,11-环氧-4-酮（1）、黑麦草内酯（2）、(4)-1-甲基-4-(1-羟基异丙基)环己烯-6-酮（3）、2-甲氧基对苯二酚（4）、4-(3-羟丙基)苯酚（5）、5-(3-羟丙基)-2-甲氧基苯酚（6）、4-甲基苯酚（7）。化合物1为新的没药烷型倍半萜，命名为怀菊花没药烷A。除化合物2外，其余化合物均为首次从该属植物中分离得到。化合物1和3有显著NO抑制作用，其半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC50）值分别为9.2、38.9 μmol/L。

怀菊花；怀菊花没药烷A；倍半萜；抗炎；(4)-1-甲基-4-(1-羟基异丙基)环己烯-6-酮；2-甲氧基对苯二酚

菊花是菊科植物菊Ramat.的干燥头状花序，味甘苦，微寒，归肺、肝经，具有疏散风热、平肝明目、清热解毒的功效[1]，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛，是卫生部首批批准的药食同源的药材之一[2]。我国药用菊花品种繁多，分布广泛，根据产地及加工方法不同，分为亳菊、滁菊、贡菊、怀菊等道地药材[3]。2020年版中国药典收录“怀菊”“亳菊”“滁菊”“贡菊”“杭菊”共同作为“菊花”入药[4]。怀菊花为“四大怀药”之一，产于河南武陟县一带，其栽培历史悠久，是药用菊花的始祖。关于怀菊花化学成分研究主要集中在茎叶中化学成分的研究等方面，而对头状花序中单体化合物的分离及活性研究甚少，为了更好地阐明其化学成分组成和药理药效基础，本实验对怀菊花化学成分进行了研究，从中分离得到了7个化合物，分别鉴定为(6,7,10)-没药烷-7-羟基-10,11-环氧-4-酮 [(6,7,10)-bisabolane-7-hydroxy-10,11-epoxide-4-one，1]、黑麦草内酯（loliolide，2）、(4)-1-甲基-4-(1-羟基异丙基)环己烯-6-酮[(4)-1-methyl-4-(1-hydroxyisopropyl) cyclohexene-6-one，3]、2-甲氧基对苯二酚（2-methoxyhydroquinone，4）、4-(3-羟丙基)苯酚[4-(3-hydroxypropyl) phenol，5]、5-(3-羟丙基)-2-甲氧基苯酚[5-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol，6]、4-甲基苯酚（4-methylphenol，7）。其中，化合物1为新的倍半萜类化合物，命名为怀菊花没药烷A；化合物3～7为首次从该植物中分离得到。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，以抑制炎性细胞因子一氧化氮（NO）的分泌为评价指标对分离得到的化合物进行体外抗炎活性评价。

1 仪器与材料

LC-52型高压半制备液相色谱仪[赛谱锐思（北京）科技有限公司]，Bruker AVANCE Ⅲ 500核磁共振仪、Bruker maxis HD型飞行时间质谱仪（德国Bruker公司），Thermo Nicolet IS10红外光谱仪（Thermo Scientific，美国），Thermo EVO300紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国），Anton Paar MCP 5 100型旋光仪（奥地利Anton Paar公司），JASCO J-810圆二色谱仪（日本Jasco公司）。CKX41型显微镜（日本Olympus光学工业株式会社），A10051560型超净工作台（AIRTECH公司），Vortex-2涡旋振荡器（Scientific Industries公司），Biofuge stratos高速低温离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），XH-C型涡旋混合器（金坛市医疗仪器厂），Proline单道可调移液器（德国Sartorius公司），EDP3-plus 电动多道移液器（美国RAININ公司），Spectra Max Plus 384酶标仪（Molecular Devices公司）。

柱色谱硅胶H（200～300目，青岛海洋化工厂），MCI Gel CHP-20柱色谱填料（日本三菱化学公司），Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（Parmacia Biotech），ODS填料（SP-120-50-ODS-B，Daisogel），聚酰胺柱色谱（60～80目，麦克林生化科技有限公司）。DMEM/RPMI 1640培养基（Invitrogen公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），DMSO（Biosharp公司），96孔细胞培养板（美国Costar公司），24孔细胞培养板（美国Costar公司），0.25%胰酶细胞消化液（Gibco），LPS（美国Sigma-Aldrich Corporation公司），G-单甲基--精氨醋酸盐（S0011，碧云天生物技术有限公司），NO测试盒（南京碧云天生物技术有限公司），亚硝酸钠（南京化学试剂股份有限公司）。

怀菊花2023年3月采自河南温县，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为菊科植物菊Ramat.的干燥头状花序。凭证样本（20230313A）存放于河南中医药大学学中药化学研究室。

2 提取与分离

怀菊花干燥头状花序5 kg使用二氯甲烷冷浸提取，料液比1∶1，提取3次，每次48 h，提取液减压浓缩得到总浸膏275 g，通过硅胶柱分离，依次使用石油醚、二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇（1∶1）溶剂洗脱，得到3个部位，石油醚部位（96 g）、二氯甲烷部位（95 g）、二氯甲烷-甲醇（1∶1）部位（81 g）。

二氯甲烷部位（95 g）通过MCI色谱柱分离，依次用10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇洗脱，得到Fr. 1～8。Fr. 3经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱、ODS柱，水-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脱、半制备HPLC，流动相（甲醇-水5∶95～1∶0）梯度洗脱，得到Fr. 3.7.2.1～3.7.2.8。Fr. 3.7.2.5经半制备HPLC，流动相（甲醇-水55∶45）等度洗脱，得到化合物1（6.32 mg，R＝30.18 min）。

Fr. 2经Sephadex LH-20柱，甲醇洗脱，得到Fr. 2.1～2.2。Fr. 2.1经ODS柱，水-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脱，得到Fr. 2.1.1～2.1.6。Fr. 2.1.4经半制备HPLC，流动相（乙腈-水20∶80）等度洗脱，得到化合物2（15.34 mg，R＝33.75 min）。Fr.2.1.5经半制备HPLC，流动相（乙腈-水25∶75）等度洗脱，得到化合物3（4.12 mg，R＝29.68 min）。Fr.2.2经半制备HPLC，流动相（乙腈-水20∶80～45∶55）等度洗脱，得到Fr. 2.2.1～2.2.5。Fr. 2.2.1经半制备HPLC，流动相（甲醇-水5∶95～40∶60）梯度洗脱，得到化合物4（2.0 mg，R＝40.50 min）。Fr. 2.2.2经半制备HPLC，流动相（甲醇-水5∶95～40∶60）梯度洗脱，得到化合物5（7.23 mg，R＝46.67 min）。Fr. 2.2.3经半制备HPLC，流动相（甲醇-水5∶95～40∶60）梯度洗脱，得到化合物6（3.01 mg，R＝22.59 min）。Fr. 2.2.4经半制备HPLC，流动相（甲醇-水32∶68）等度洗脱，得到化合物7（2.63 mg，R＝26.95 min）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，[α]25 D＋12（0.03, CH3OH）。HR-ESI-MS给出/为275.161 6 [M＋Na]+（计算值为275.161 8），说明其分子式为C15H24O3，不饱和度为4。UV（甲醇）显示该化合物的最大吸收波长在236 nm处。IR (KBr) 光谱数据显示该化合物具有羟基(3 438 cm−1)，羰基(1 671 cm−1)。在1H-NMR谱图(500 MHz, CDCl3) 中，显示4个特征甲基信号(H1.78, s; 1.20, s; 1.17, s; 1.12, s)，1个烯氢质子信号(H6.73, m)，1个连氧氢质子信号(H3.78, m)。13C-NMR、HSQC数据显示有15个碳信号，包括12个sp3杂化碳原子[含有4个甲基、4个亚甲基、2个次甲基(包括1个连氧碳C84.4) 和2个季碳(分别为连氧碳C83.8, 71.6)] 以及3个sp2杂化碳原子(包括1个酮羰基C200.4以及2个烯碳C144.8, 135.6)。以上数据表明化合物1应该是1个倍半萜类化合物。

在HMBC图谱中，显示H2-1与C-2/C-3/C-7相关（图1）；烯氢质子H-2与C-1/C-3/C-4/C-6相关；H3-15与C-2/C-4相关；H-5与C-4/C-7相关；H3-14与C-6/C-7/C-8相关；H2-9与C-7/C-10/C-11相关；H-10与C-8/C-12/C-13相关；H3-12与H3-13皆与C-10/C-11相关，说明化合物1具有没药烷倍半萜骨架结构。其中烯氢H-2 (H6.73, m) 与C-2 (C144.8), C-3 (C135.6), C-4 (C200.4) 以及H-5与C-4存在HMBC相关，说明C-2, C-3, C-5位存在α,β不饱和酮。H3-14, H2-1, H2-5以及H2-8皆与连氧季碳C-7 (C83.8) 相关，说明C-7连接有羟基；H3-12, H3-13皆与连氧碳C-10 (C84.4), C-11 (C71.6) 相关，且除去α,β不饱和酮及没药烷倍半萜骨架中的六元环，还剩余1个不饱和度，说明C-10与C-11为形成三元氧环。

图1 化合物1的结构和关键的HMBC相关

在ROESY谱图中，可以看到明显的H-6与H3-14相关，但由于C-7为链上的sp3杂化碳，可自由旋转，不能通过ROESY相关确定其相对构型。另外由于C-10侧链在侧链上且距离发射团α、β不饱和酮较远，因此对CD图谱数据贡献较小。综上，首先采用计算ECD方法确定C-6、C-7位的构型。采用IEFPCM模型在甲醇中针对(6,7)-1、(6,7)-1、(6,7)-1和(6,7)-1在CAM-B3LYP/ DGDZVP水平计算得到的ECD谱见图2，可知(6,7)-1的ECD谱与实验ECD谱相吻合。其次，采用计算碳谱的方法进一步确定C-10位构型，通过DP4＋分析确定其构型10。因此，最终确定该化合物为(6,7,10)-没药烷-7-羟基-10,11-环氧-4-酮，命名为怀菊花没药烷A，其1H-NMR和13C-NMR谱信号归属见表1。

图2 化合物1的计算ECD曲线和实测ECD曲线

表1 化合物1的核磁数据(500/125 MHz, CDCl3)

化合物2：无色针晶（甲醇）。ESI-MS/: 197.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 5.69 (1H, s, H-10), 4.32 (1H, m, H-5), 2.46 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, dt,= 14.5, 2.7 Hz, H-4a), 1.78 (3H, s, H-7), 1.77 (1H, m, H-6b), 1.52 (1H, dd,= 14.5, 2.7 Hz, H-4b), 1.46 (3H, s, H-1), 1.27 (3H, s, H-2)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 26.4 (C-1), 26.9 (C-2), 36.0 (C-3a), 45.5 (C-4a), 66.4 (C-5a), 47.1 (C-6a), 30.6 (C-7), 187.1 (C-8), 172.1 (C-9), 112.4 (C-10), 183.0 (C-11)。以上数据与文献报道比对基本一致[5]，故鉴定化合物2为黑麦草内酯。

化合物3：黄色粉末，易溶于甲醇。ESI-MS/: 169.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6.76 (1H, dd,= 6.4, 2.2 Hz, H-2), 2.61 (1H, m, H-5a), 2.45 (1H, m, H-5b), 2.24 (1H, m, H-3a), 2.06 (1H, m, H-3b), 1.78 (3H, s, H-7), 1.21 (3H, s, H-10), 1.20 (3H, s, H-9)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 135.0 (C-1), 144.6 (C-2), 26.8 (C-3a), 49.4 (C-4a), 39.6 (C-5a), 200.2 (C-6a), 15.6 (C-7), 71.5 (C-8), 27.3 (C-9), 27.1 (C-10), 183.0 (C-11)。以上数据与文献报道比对基本一致[6]，故鉴定化合物3为(4)-1-甲基-4-(1-羟基异丙基) 环己烯-6-酮。

化合物4：黄色粉末，易溶于甲醇。ESI-MS/: 141.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 6.76 (1H, d,= 2.8 Hz, H-6), 6.45 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 6.33 (1H, dd,= 8.6, 2.8 Hz, H-2), 3.86 (3H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 149.4 (C-1), 99.7 (C-2), 147.2 (C-3), 139.7 (C-4), 114.4 (C-5), 106.8 (C-6), 56.1 (C-7)。以上数据与文献报道比对基本一致[7]，故鉴定化合物4为2-甲氧基对苯二酚。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MS/: 153.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7.04 (1H, d,= 8.4 Hz, H-3), 7.06 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.74 (1H, d,= 8.4 Hz, H-2), 6.76 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 3.67 (2H, t,= 6.4 Hz, H-9), 2.64 (2H, t,= 7.7 Hz, H-7), 1.86 (2H, dq,= 7.7, 6.4 Hz, H-8)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 155.7 (C-1), 111.4 (C-2), 130.1 (C-3), 136.8 (C-4), 130.1 (C-5), 111.4 (C-6), 31.5 (C-7), 33.9 (C-8), 62.1 (C-9)。以上数据与文献报道比对基本一致[8]，故鉴定化合物5为4-(3-羟丙基) 苯酚。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MS/: 183.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 6.83 (1H, d,= 7.9 Hz, H-3), 6.69 (1H, dd,= 7.9, 2.0 Hz, H-4), 6.71 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 3.88 (3H, s, H-10), 3.68 (2H, t,= 6.4 Hz, H-9), 2.64 (2H, t,= 7.7 Hz, H-7), 1.87 (2H, m, H-8)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 144.7 (C-1), 145.7 (C-2), 110.9 (C-3), 119.9 (C-4), 135.3 (C-5), 114.9 (C-6), 31.6 (C-7), 34.4 (C-8), 62.4 (C-9), 56.2 (C-10)。以上数据与文献报道比对基本一致[9]，故鉴定化合物6为5-(3-羟丙基)-2-甲氧基苯酚。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MS/: 109.1 [M＋H]+。1H-NMR (500 MHz, CDCl3): 7.90 (1H, d,= 8.3 Hz, H-3, 5), 6.89 (1H, d,= 8.3 Hz, H-2, 6), 2.56 (3H, s, H-7)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 152.9 (C-1), 115.4 (C-2), 130.2 (C-3), 130.3 (C-4), 130.2 (C-5), 115.4 (C-6), 20.5 (C-7)。以上数据与文献报道比对基本一致[10]，故鉴定化合物7为4-甲基苯酚。

4 抗炎活性

本实验对分离得到的化合物通过对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生NO抑制作用来评价其抗炎活性[11]。取生长状态良好且处于对数生长期的RAW264.7细胞，用DMEM完全培养基配制成单细胞悬液，细胞计数，以1×105个/mL，每孔100 µL均匀接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h。设置空白组（仅DMEM培养基）、模型组（1 µg/mL LPS）、实验组[1 µg/mL LPS＋（1、10、20、40、80、100 µmol/L化合物）]，每组3个复孔。培养24 h，取其上清液于离心管中，采用Griess试剂盒操作方法，检测细胞培养液中NO的含量。采用NO合酶抑制剂G-单甲基--精氨醋酸盐作为阳性药对照。同时，通过CCK-8试验评估RAW264.7细胞的活力，以排除化合物的细胞毒性干扰。用酶标仪在540 nm测定各孔吸光度（）值，计算抑制率和IC50值。

NO抑制率＝(模型－实验)/(模型－空白)

对化合物1～7在LPS诱导的RAW264.7细胞株上进行了NO抑制活性筛选，结果表明，与模型组相比，化合物1在50 μmol/L浓度时的NO抑制率为80.2%，其IC50值为9.2 μmol/L，化合物3在50 μmol/L时的NO抑制率为60.2%，其IC50值为38.9 μmol/L，1和3能显著抑制LPS诱导RAW264.7释放NO量，具有显著的抗炎活性，其他化合物活性并不显著，阳性药G-单甲基--精氨醋酸盐IC50值为22.1 μmol/L。

5 讨论

本研究从怀菊花中分离并鉴定了7个化合物，其中化合物1为新的没药烷型倍半萜类化合物，化合物3～7为首次从该属植物中分离得到。倍半萜类化合物广泛分布于菊科、伞形科、姜科、败酱科等植物中，具有抗癌、抗菌等作用。本研究发现化合物1具有显著的抗炎活性，这对倍半萜类化合物以及怀菊花的进一步研究提供良好的理论基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 中国药典[S]. 一部. 2020: 193-194.

[2] 李孟, 张靖柯, 石静亚, 等. 怀菊花及其茎叶脂溶性成分GC-MS分析及其抗氧化活性研究 [J]. 中国医药科学, 2020, 10(19): 78-82.

[3] 谢媛媛, 袁丹, 田慧芳, 等. 怀菊花化学成分的研究 [J]. 中国药物化学杂志, 2009, 19(4): 276-279.

[4] 杨颖, 石静亚, 李孟, 等. 怀菊花茎叶中酚类化学成分研究 [J]. 中药材, 2022, 45(4): 866-869.

[5] Willuhn G, Westhaus R G. Loliolide (calendin) from[J]., 1987, 53(3): 304.

[6] Zhao Y R, Wu Y S, De Clercq P,. Asymmetrization of all-cis-3, 5-dihydroxy-1-(methoxycarbonyl)cyclohexane and of the 4-methyl and 4-ethyl substituted homologues [J]., 2000, 11(19): 3887-3900.

[7] Chen S, Hossain M S, Foss F W Jr. Organocatalytic dakin oxidation by nucleophilic flavin catalysts [J]., 2012, 14(11): 2806-2809.

[8] Han C, Huang Z J, Zheng C,. Nitric oxide donating anilinopyrimidines: Synthesis and biological evaluation as EGFR inhibitors [J]., 2013, 66: 82-90.

[9] Cao Y X, Silalai P, Liu C F,. Hypervalent-iodine(III)-mediated tandem oxidative dearomatization/aziridination of phenolic amines: Synthesis of functionalized unactivated aziridines [J]., 2021, 27(33): 8473-8478.

[10] Kokotos C, Sideri I, Voutyritsa E. Green photoorganocatalytic synthesis of phenols from arylboronic acids [J]., 2018, 29(10): 1324-1328.

[11] Yang B Y, Guo R, Li T,. New anti-inflammatory with anolides from the leaves ofL. [J]., 2014, 87: 26-34.

A new bisabolane-type sesquiterpenoid from

CAI Yajun1, XUE Jinfeng1, ZHAO Huijun3, ZHI Yanle1, LU Jiheng1, CHEN Hui1, WANG Yanzhi1, FENG Weisheng1, XUE Guimin1, 2

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Collaborative Innovation Center of Research and Development on the Whole Industry Chain of Yu-Yao, Egineering and Technology Center for Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046, China 3. Zhengzhou Shuqing Medical College, Zhengzhou 450046, China

To study the chemical constituents from.The extract fromwas isolated and purified by silica gel column, ODS, Sephadex LH-20 and semi-preparative HPLC. Their structures were identified by spectral analysis combined with literature. Inhibiting the secretion of inflammatory cytokine nitric oxide (NO) was used as the evaluating indicator, the model of lipopolysaccharide (LPS)-induced mouse macrophage RAW264.7 cells was used to evaluate the inanti-inflammatory activity of isolated compounds.A total of seven compounds were obtained from the dichloromethane extract ofand their structures were identified as (6,7,10)-bisabolane-7-hydroxy-10,11-epoxide-4-one (1), loliolide (2), (4)-1-methyl-4-(1-hydroxyisopropyl)cyclohexene-6-one (3), 2-methoxyhydroquinone (4), 4-(3-hydroxypropyl)phenol (5), 5-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol (6), 4-methylphenol (7).Compound 1 is a new bisabolane-type sesquiterpenoid, named chrysanbisabane A. All compounds except compound 2 were isolated from this genus for the first time. Compounds 1 and 3 showed a significant NO inhibition activity with median inhibition concentration (IC50)values of 9.2 μmol/L and 38.9 μmol/L, respectively.

Ramat; chrysanbisabane A; sesquiterpenes; anti-inflammation; (4)-1-methyl-4-(1-hydroxy- isopropyl)cyclohexene-6-one; 2-methoxyhydroquinone

R284.1

A

0253 - 2670(2024)09 - 2863 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.09.001

2024-02-22

国家自然基金资助项目（82003606）；河南省高校科技创新团队支持计划资助（24IRTSTHN039）

蔡雅君（1998—），硕士研究生，研究方向为中药药效物质基础。E-mail: yajun027@163.com

通信作者：薛贵民（1988—），副教授，硕士研究生导师，研究方向为中药药效物质基础。E-mail: xueguimin123@126.com

薛金凤（1987—），实验师，研究方向为中药药效物质基础。E-mail: xuejinfeng8804@126.com

[责任编辑 王文倩]