骨髓间充质干细胞来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用研究

马 骢，李 刚，马亮亮，李 想，张永泼

1.河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院）康复医学科，河南 郑州 450003；2.河南省洛阳正骨医院（河南省骨科医院）小儿外科，河南 郑州 450003；3.河南省组织细胞库有限公司，河南 郑州 450000

脊髓损伤是脊柱骨折的严重并发症，从病理解剖上可将脊髓损伤分为原发损伤和继发损伤，主要表现为四肢功能活动障碍、大小便功能障碍等，容易给患者的脊髓造成严重的功能损伤［1］。脊髓损伤的主要危害为各系统都可出现临床症状，且症状取决于损伤的部位，还有可能造成患者的下肢功能障碍，且神经传导通路最终都是传到脑部，颈椎、胸椎和腰椎损伤也可能发生大小便控制障碍［2］。此外，患者还会出现疼痛、感觉异常、肢体痉挛，同时导致患者社会参与度下降，给患者的生存质量造成严重影响。干细胞研究是继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科学领域。随着我国医疗水平的不断提升，骨髓间充质干细胞（BMSCs）不仅能够有效抑制炎症的产生，同时还能促进神经轴突以及血管的再生，对于恢复患者的运动神经功能具有较好的作用［3］。外泌体具有在体内进行生物信息传输的作用。有研究［4］表明静脉注射BMSCs对于治疗外泌体具有较好的作用，且在各种脑卒中、创伤性脑损伤等治疗及后续修复中具有较好的作用。基于此，本研究将以大鼠模型实验为基础，分析BMSCs 来源的外泌体静脉移植对脊髓损伤的修复作用，以期为我国临床外泌体移植治疗神经系统损伤治疗提供一定的指导。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013 年10 月—2014 年3 月河南省洛阳正骨医院实验室试验的78 例大鼠为研究对象，大鼠体重为175～200 g，由省实验动物中心提供。应用随机抛球法将大鼠分为手术组（n=26）、对照组（n=26）、外泌体组（n=26）。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 实验仪器及试剂

本实验采用脊髓打击器、倒置显微镜、CO2孵育箱、透射电子显微镜、光学显微镜、L-DMEM 培养基、外泌体提取试剂盒ExoQuick-TCExosomeIsolationReagent、CD9、CD63、LuxolFastBlue髓鞘染色液进行实验。

1.3 方法

应用脊髓打击器建立大鼠脊髓损伤模型后，对照组不作处理，手术组在对照组的基础上实施切开减压术，而外放体组在对照组的基础上实施外放体移植，具体措施如下。（1）大鼠BMSCs 分离培养。采用全骨髓贴壁法进行BMSCs 的体外分离和培养，腹腔内应用10%水合氯醛（0.3 mL/kg）、75%乙醇进行全身消毒。在无菌条件下分开两个股骨胫骨，剪断干骺端露出髓腔，将L-DMEM 培养液从骨髓中排出。经1 000 r/min 离心5 min 后，将上清液用10%的体积含量的L-DMEM 培养液进行再悬浮，再用1×106/L 的浓度进行接种，在37 ℃、5%CO2的恒温下培养。24 h 时进行第一次半量换液，其后2 d 进行全剂量换液。采用倒置显微镜对BMSCs 进行形态学观察，在80%～90%的贴壁细胞中进行融合，0.25%的胰酶将其消化，以1∶2的比例进行传代。（2）外泌体的分离及观察。将用不含外泌体的血浆制备的P2 代MSCs 培养24 h。采集培养液，按照ExoQuick 推荐的方法取20 mL 培养液，用3 000 g 的相对离心力（3 000 倍重力加速度）离心15 min，将细胞残渣除去，用5∶1/5 的上清液加入外泌体萃取液，混合均匀，4 ℃孵化一晚，放入离心机，1 500 g 离心30 min，去上清，底部沉淀即为外泌体。应用透射电镜观察并对其进行表征、PBS 重悬及BCA 蛋白含量的检测。调整之后的浓度控制为200 μg/mL，放置于80 ℃的温度中保存。保存完成之后放置于室温中吸附多余的液体进行晾干。在造模24 h 后，取2 只外泌体大鼠经4%戊二醛深度麻醉后，取T10脊髓节段，经常规脱水、浸透等处理，电镜下观察外泌物是否已抵达脊髓［5］。（3）外泌体表面标志物鉴定。用20 mL 的细胞培养上清进行体外培养，然后放入300 μL 的溶解液混合冰溶解30 min，再放入4 ℃低温超高速离心机10 000 r/min 离心5 min，将其上清分装，用BCA 方法进行蛋白含量测定。提取30 μg总蛋白，将其放入1/4上样缓冲液中，99 ℃水浴10 min。将30 μL 的样品分离，再用半干燥方法将其电转移至PVDF 膜上，37 ℃封闭2 h，CD9 和CD63（1∶1 000 稀释）4 ℃过夜，用等渗缓冲盐溶液冲洗薄膜5 min×4次，用辣根过氧化物酶标记的IgG（1∶1 000比例稀释）37 ℃孵育2 h，PBS冲洗2次，增强化学发光法测定暗室曝光。

1.4 观察指标

（1）分别采用BBB 评分、斜板实验评价构造后1、3、7、14、21、28 d 的后肢功能情况［6］。BBB 评分共22 个等级：0 分为后腿完全麻痹；21 分为功能正常。采用两位有经验的观察者双盲评定，主要观察关节的活动，运动负荷和运动幅度，前肢、后肢和尾巴的协调。斜板实验：将大鼠放在与平板垂直轴线相垂直的平板上，各测试倾斜板倾斜度每次增大5°，当大鼠在最大角度停留5 s 后，记录斜板倾斜度为斜板实验得分。由两名经验丰富的观察者对不同时间段的结果进行评分。（2）脊髓组织形态学观察［7］：对脊髓损伤后28 d 各组大鼠进行心脏麻醉冲洗实验，将4%的多聚甲醛注入大鼠心脏，并取出脊髓组织进行常规脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡等处理。采用苏木精-伊红（HE）染色，苏木素染色5 min，水洗3次，盐酸乙醇分色20 s，再用1%伊红液在水中浸泡5 min；髓鞘（LFB）染色：用Luxol固蓝液浸泡一夜，用95%乙醇浸泡3 min，用乙醇浸泡3 min，用0.05%碳酸锂溶液浸泡15 min，再用70%乙醇进一步分化30 s，直至能清晰地辨别出灰白，观察各组脊髓组织形态学改变。采用尼氏（Nissl）染色染色：用1%甲苯胺蓝染色法对切片进行10 min 的观察，然后用常规的梯度法进行脱水，观察神经元存活数目。所有指标观察均取5张计数平均值进行分析。

1.5 统计学方法

应用SPSS 24.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，经正态性检验与方差齐性检验后，正态分布且方差齐性的计量资料，组间比较行LSD-t检验，组内比较行单样本t检验，偏态分布的数据用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

所有大鼠均在术前1 d、术后1 d 行BBB 评分，术前1 d 评分结果显示所有大鼠的运动功能均能正常开展实验，术后1 d评分结果显示，所有大鼠均未出现异常死亡情况，可常规开展实验。

2.1 BMSCs的形态观察

在体外培养24 h后，观察到部分细胞贴壁，细胞的大小和形状以圆形居多，见图1。培养4～5 d 后细胞壁的数量逐渐增多，且呈现出集落的增长趋势。培养10 d后，细胞开始呈现出融合趋势，且胰酶消化开始出现传代，传至2 代之后，细胞呈现出单一均匀趋势，与BMSCs 的生长形态一致，见图2。

图1 体外培养24 h后的细胞形态

图2 体外培养10 d后的细胞形态

2.2 三组大鼠的行为学评价情况

所有大鼠术前BBB 评分均为21 分，术后各时间点手术组后肢得分正常，术后1 d 对照组及外泌体组BBB 得分均为0，大鼠下肢功能减退，以卧式拖动方式运动，但随着时间的增加，大鼠的BBB 评分逐一恢复。术后各时间点手术组大鼠BBB评分高于对照组和外泌体组，术后7、14、21、28 d外泌体组大鼠BBB 评分高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。手术组术后各时间点斜板评分高于对照组及外泌体组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 三组大鼠不同时间点的BBB评分情况（±s）

表1 三组大鼠不同时间点的BBB评分情况（±s）

a 表示与同一时间段手术组比较，P＜0.05；b 表示与同一时间段对照组比较，P＜0.05。

项目术前1 d术后1 d术后3 d术后7 d术后14 d术后21 d术后28 d手术组（n=26）21.00±0 19.80±0.75 20.30±0.67 20.90±0.33 21.00±0 21.00±0 21.00±0对照组（n=26）21.00±0 0±0a 0.90±0.87a 2.50±1.07a 6.90±0.98a 10.50±0.84a 12.50±1.07a外泌体组（n=26）21.00±0 0±0a 1.61±0.85a 6.30±0.94ab 12.70±1.58ab 16.60±1.07ab 17.01±0.68ab

表2 三组大鼠不同时间点的斜板实验评分情况（±s）

表2 三组大鼠不同时间点的斜板实验评分情况（±s）

a 表示与同一时间段手术组比较，P＜0.05；b 表示与同一时间段对照组比较，P＜0.05。

项目术前1 d术后1 d术后3 d术后7 d术后14 d术后21 d术后28 d手术组（n=26）80.00±0 75.00±3.32 78.80±2.41 79.00±2.12 80.00±0 80.00±0 80.00±0对照组（n=26）80.00±0 29.00±3.15a 30.00±2.35a 34.00±3.15a 43.00±4.21a 49.00±4.58a 52.50±4.25a外泌体组（n=26）80.00±0 30.00±3.32a 32.50±3.55a 43.00±3.51ab 55.50±4.37ab 62.51±2.65ab 65.00±3.32ab

2.3 脊髓组织形态学变化

术后28 d，手术组的脊髓组织HE 染色体等均正常，神经元数目减少。术后28 d 脊髓组织HE 染色，见图3。手术组脊髓组织结构完整，神经细胞形态正常，神经纤维排列规整，细胞基质较均匀，见图4。对照组损伤区脊髓组织结构紊乱，大量炎性细胞浸润，见图5。外泌体组损伤区脊髓组织炎性浸润较少，组织较连续、结构较清晰，见图6。

图3 术后28 d脊髓组织HE染色

图4 手术组脊髓组织HE染色

图5 对照组损伤区脊髓组织HE染色

图6 外泌体组损伤区脊髓组织HE染色体损伤

3 讨论

脊髓损伤是当前临床中较为常见的一种症状，严重时会出现完全性瘫痪、肢体功能丧失、大小便完全失禁等，增加患者的心理负担和经济压力。间充质干细胞（MSCs）是一类多能干细胞，是目前临床上最常用的一种干细胞，结合造血干细胞移植可以增加移植成功率，加快造血再生［8］。在大剂量的化疗后，BMSCs联合造血干细胞一起注入，有利于患者的血液细胞恢复，而且副作用小、安全性高。有研究［10］表明，MSCs 相较于其他的细胞能够分泌出更多的外泌体。

本研究结果显示，体外培养24 h后，观察到部分细胞贴壁，细胞的大小和形状以圆形居多。有研究［11-12］的实验结果表明，在实验中使用CD9、CD63 进行阳性的检验，最终得出的实验的提取物为MSCs，与本研究的结果一致。MSCs 外泌体是由MSC 分泌的具有脂质双层膜结构的纳米级细胞外囊泡。Zhang等［13］的研究结果提示，体外培养的骨髓基质细胞能抑制细胞因子、抑制NF-κBp65信号途径，降低caspase-3、caspase-8、caspase-9 等细胞凋亡，进而抑制细胞凋亡。脊髓损伤后的运动功能恢复一直以来都是临床重点关注的课题。本研究通过选择大鼠实验为研究对象，采用脊髓打击器的方式对大鼠进行打击并建构模型，分析术后的运动功能的恢复情况。本研究结果显示，经打击后，大鼠的各项下肢功能有丧失的情况，且BBB 评分和斜板实验评分急剧下降，后续有恢复的情况，但整体的恢复无法达到打击之前的状态。且本研究中对照组及外泌体组的BBB评分低于手术组；外泌体组的BBB评分高于对照组；外泌体组术后各项斜板评分高于对照组，提示外泌体静脉移植对脊髓损伤具有一定的恢复作用。本研究中术后28 d，手术组的脊髓组织HE 染色体等均正常，神经元数目减少。分析其原因为，通过外泌体静脉移植BMSCs的外泌体可以通过血脑屏障进入组织损害，并能携带生物信息进行修复，而以滴鼻方式移植后6 h，可在大脑皮层、海马等区域观察到外泌体的存在［14］。

综上所述，BMSC 外泌体静脉移植对脊髓损伤有明显的改善作用，可以提高患者的运动能力，减轻脊髓损伤，并能加速脊髓损伤的恢复。