磷脂酶A2 氨基末端衍生肽的合成及其抗细菌活性的研究

安 娜 李 艳 廖柳凤 梁宁生

广西医科大学附属肿瘤医院临床药学科，广西南宁 530021

目前，多重耐药菌已经广泛分布全世界各地，研究表明，我国革兰氏阴性杆菌的耐药高于革兰氏阳性球菌及真菌，甚至有些对碳青霉烯类抗菌药物出现了耐药[1-5]。抗菌肽是广泛存在于生物体内的天然多肽，其具有广谱抗菌等特点[6-8]。人们相继从高等动植物中分离获得抗菌肽，并发现抗菌肽对部分细菌、真菌、病毒及癌细胞等均具有强有力的杀伤作用[9-10]。大量的文献报道这些分子是高度特异性的抗微生物化合物，极具成为新型抗菌药物的潜力[11-15]。因此，对抗菌肽的杀菌活性研究逐渐成为热点。磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）是一类能够参与水解磷脂sn-2 键的酶，具有抗菌、抗感染、抗肿瘤等多种生物活性[16-17]。近年来，越来越多的研究表明，PLA2氨基末端衍生肽在抗细菌感染方面具有重要作用[18-20]。为了进一步探讨其抗细菌活性的机制，本文研究了PLA2氨基末端衍生肽的合成及其抗细菌活性。

1 材料与方法

1.1 PLA2 氨基端肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 的合成

①材料准备：细胞培养液（批号：2010060303）、血清（批号：19110502）、胰蛋白酶（批号：2009240202）、胶原蛋白酶（批号：9001121）等，上述试剂均由浙江森瑞生物科技有限公司提供。②细胞培养：将细胞培养在适当的条件下，待细胞生长到所需密度后，加入胰蛋白酶和胶原蛋白酶进行消化。③提取PLA2：将消化后的细胞离心，取上清液，加适量硫酸铵溶液沉淀。沉淀物即为PLA2。④氨基端肽的制备：将PLA2溶解在缓冲液中，加入胰蛋白酶水解，得到氨基端肽。⑤纯化氨基端肽：将水解产物进行离子交换和凝胶过滤色谱，得到纯化的氨基端肽。在Fmoc 固相合成法中α-氨基用Fmoc 保护基（图1）进行保护，侧链则采用Boc作为保护基。所有的抗菌肽均由上海波泰生物科技有限公司根据本研究的设计合成。

图1 Fmoc 固相合成法合成多肽机制与工艺流程

图2 PLA2 氨基末端衍生肽质谱图

1.2 PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 的杀菌实验

1.2.1 仪器Thermo 420 型恒温气浴摇床为美国Thermo Electron 公司产品；J3-NAPCO-5410 型二氧化碳培养箱购自克勒格瓦尼（上海）分析仪器有限公司；微量加样器1 000、200、50、10 μl 各1 支购自日本NICIRYO公司；pH 计购自美国ORION Research 公司；HWS-20恒温水浴箱购自江苏太仓市实验设备厂；漩涡振荡器购自江苏海门市麒麟医用仪器厂；Anke TGL-16C 台式离心机购自上海安亭科学仪器厂；Hettic 台式高速冷冻离心机320/320R 购自德国Hettic 公司；TU-1810S紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司；Techcompvis7200 可见分光光度计购自上海天美科学仪器有限公司。

1.2.2 细菌标准株 革兰氏阳性菌：枯草杆菌（ATCC 63501）；一种革兰氏阴性菌：大肠埃希菌（ATCC44113）。以上标准菌株均来自广西医科大学微生物学教研室。

1.2.3 药品与试剂①上海波泰生物科技有限公司合成的PLA2氨基末端11、15、20 个氨基酸残基的多肽PLA2N11（批号：10081311，纯度≥95%）、PLA2N15（批号：10101326，纯度≥98%）、PLA2N20（批号：10101479，纯度≥98%）。②4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes，批号：230-907-9）和1%小牛血清白蛋白（BSA，批号：A8010）购自北京Solarbio 公司。③LB 培养基粉（批号：1009533）及LB 营养琼脂（批号：100127）购自生物工程（上海）有限公司。④RPMI 1640（批号：970810）购自GIBCOBRL 公司。

1.3 杀菌实验方法

采用琼脂铺板计数法。①细菌培养：取过夜的枯草杆菌和大肠埃希菌按照1∶50 的比例加入3 ml 的新鲜LB 培养液中，置于37℃的恒温摇床孵育2.5 h，达到对数生长期。②菌液制备：室温下1 000 r/min 离心45 s 后收集细菌，用生理盐水洗涤细菌并再次离心，弃上清液，将所得细菌沉淀物溶于500 μl 灭菌生理盐水。③实验分组：制备RPMI-1640 反应体系，依次将10 μl 细菌和10 μl 多肽（实验组，其作用浓度分别为7.81、31.25、125.00、500.00 μg/ml）或生理盐水（对照）加入80 μl 反应体系中，混匀，置于37℃的恒温水浴锅中2h。④计算杀菌率：2h 后取出反应液40μl，以灭菌生理盐水进行10 倍稀释，保存于无菌培养皿中，加入LB 营养琼脂6 ml 摇匀，37℃恒温箱中过夜培养。杀菌率=（1-实验组菌落形成单位）/对照菌落形成单位×100%。合成后进行纯度检测、分子量检测及稳定性检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据处理。采用origin 8.0 进行图像绘制，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLA2 氨基末端衍生肽的一级结构特点

PLA2N11含有2 个碱性氨基酸（2 个赖氨酸），该蛋白质具有两个正电荷的侧链基团。氨基酸之间通过肽键相连，形成了肽链。PLA2N15含有4 个碱性氨基酸；与PLA2N11比较，PLA2N15具有更多的碱性氨基酸，具有更多的正电荷侧链基团。PLA2N15的第一个特点在于其丰富的脯氨酸和赖氨酸。PLA2N15中谷氨酸和天冬氨酸含量较高。PLA2N20含有7 个碱性氨基酸（4 个赖氨酸，2 个精氨酸，1 个组氨酸），PLA2N20具有更多的碱性氨基酸，正电荷侧链基团更强。PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20均不含酸性氨基酸。此外，疏水性氨基酸比例较高，PLA2N20可达到0.600。PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20质谱图。见图2。

2.2 多 肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20对枯草杆菌杀菌活性比较

与对照比较，多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20对革兰氏阳性菌枯草杆菌杀菌活性更强，各多肽间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；当多肽作用浓度为500.00 μg/ml 时，PLA2N15对枯草杆菌杀菌率可达99.8%，高于PLA2N11、PLA2N20，及对照（P＜0.05）。见表1。

表1 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 对枯草杆菌杀菌活性比较（%，，n=4）

表1 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 对枯草杆菌杀菌活性比较（%，，n=4）

注 与对照比较，aP＜0.05；与PLA2N11 比较，bP＜0.05；与PLA2N15 比较，cP＜0.05。PLA2：磷脂酶A2。

2.3 多 肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20对大肠埃希菌杀菌活性比较

与对照比较，各多肽不同作用浓度时对大肠埃希菌杀菌活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；多肽作用浓度为7.81、125.00、500.00 μg/ml 时，PLA2N15的杀菌活性均高于PLA2N11和PLA2N20（P＜0.05）；多肽作用浓度为31.25 μg/ml 时，PLA2N15的杀菌活性低于PLA2N11的杀菌活性，且高于PLA2N20的杀菌活性（P＜0.05）。见表2。

表2 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 对大肠埃希菌杀菌活性比较（%，，n=4）

表2 多肽PLA2N11、PLA2N15、PLA2N20 对大肠埃希菌杀菌活性比较（%，，n=4）

注 与对照比较，aP＜0.05；与PLA2N11 比较，bP＜0.05；与PLA2N15 比较，cP＜0.05。PLA2：磷脂酶A2。

3 讨论

抗菌肽通过静电吸引力与细菌细胞膜带负电荷的磷脂结合，引起膜破裂，最终导致细菌死亡[21]。本研究的杀菌试验选择了枯草杆菌和大肠埃希菌，结果表明，当作用浓度为500.00 μg/ml 时PLA2N15对枯草杆菌、大肠埃希菌的杀菌率分别为99.8%、56.4%，优于PLA2N11、PLA2N20。关于PLA2N15在动物或人体内的使用浓度需要进一步的科学研究和实验验证。在动物或人体内，药物浓度受到许多因素的影响，包括药物的吸收、分布、代谢和排泄等。因此，预测PLA2N15在人体内的浓度需要基于药代动力学模型和相关参数的测定。需要注意的是，药物在体内的浓度并不是越高越好，而是需要在达到治疗效果的同时，避免出现不良反应。结合本研究的结果，多肽的抗菌活性与其携带的净正电荷及碱性氨基酸数量的密切相关，但不一定是正相关。部分抗菌肽表现出随正电荷适当增加而杀菌活性增强，其可能原因是抗菌肽与细菌之间的静电吸引力增强[22-23]。

在确定合成肽的抗细菌活性过程中，需要进行大量的细菌培养和药敏实验。尽管面临挑战，但此研究仍具有明显的优势，通过合成PLA2氨基末端衍生肽，有可能开发出一种全新的抗细菌感染策略，对于解决日益严重的抗菌药物耐药性问题具有重要意义[24]。但该研究也存在一定的局限，实验成本较高，实验周期较长。另外尽管在实验室内合成的肽可能具有抗细菌活性，但在临床转化为实际治疗手段的过程中可能面临诸多挑战，例如安全性、有效性、生产成本等问题。

目前，随着抗生素在临床应用的增加，耐药问题越来越突出。抗菌肽则具有杀菌快速、抗菌谱广、毒副作用小、无免疫原性等优点。且由于其特殊的杀菌机制，被抑制或杀灭的病原性微生物不会产生抗性菌株，不会由于耐药性而减弱杀灭细菌的作用[25]。随着技术的不断发展和研究的不断深入，最终这些困难会得到克服。期待更多具有很好抗菌活性的抗菌肽不断出现，为人类抵抗多重耐药菌提供一道防线。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。