尿脱落细胞FISH单染色体拷贝大量异常分析

汤永飞,何惠华,阎红琳,刘 琳,袁静萍,钱 红

尿脱落细胞的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)已被应用于尿路上皮癌的筛查诊断,相较于传统的尿脱落细胞学检查,具有更高的敏感性和特异性;此外,还可用于尿路上皮癌的疗效评估及复发监测。然而,由于尿路上皮癌分子改变的异质性和低级别尿路上皮癌FISH检测的低敏感性,往往会导致一部分患者漏诊。目前,尿脱落细胞FISH阳性诊断标准是计数25个形态异常细胞：≥4个细胞出现2种染色体多倍体;≥4个细胞出现1种染色体多倍体,合并p16基因>12个细胞出现纯合子缺失。本文作者在工作实践中发现5例尿脱落细胞FISH单染色体拷贝大量异常,即仅出现一种染色体单/多倍体或p16基因杂合子缺失,但这种异常细胞数量较大,这种情况应如何判读仍存在争议,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2020年1月～2022年7月武汉大学人民医院病理科行尿脱落细胞FISH检测的847例患者临床病理资料。依据FISH阳性诊断标准,筛选出5例不符合阳性诊断标准、但存在单染色体拷贝大量异常(本研究单染色体拷贝大量异常界定为100个异常细胞中出现>30个单染色体拷贝异常细胞)的5例作为研究对象。另外842例中,FISH检测结果为阳性143例,阴性690例,可疑阳性9例。

1.2 方法

1.2.1FISH检测 患者留取晨尿和夜尿(300～500 mL)放置于尿液保存液内,2 000 r/min离心5 min弃上清(留取1～2 mL),加入PBS重悬细胞沉淀,再加入0.075 mol/L氯化钾低渗液混匀,37 ℃水浴15 min,然后加入2 mL固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1),2 000 r/min离心10 min弃上清;加入10 mL固定液混匀后-20 ℃静置30 min,选择合适细胞浓度滴片。老化玻片30 min,37 ℃酶消化6 min,1%多聚甲醛固定10 min,反复冲洗、梯度乙醇脱水、自然晾干,加探针85 ℃变性5 min,37 ℃杂交过夜。洗涤后加DAPI,荧光显微镜下观察。

1.2.2FISH结果判读 FISH检测采用康录公司的膀胱癌检测试剂盒,探针包括Ⅰ区标记3、7染色体,对应红色信号点、绿色信号点;Ⅱ区标记p16基因和17号染色体,对应红色信号点、绿色信号点。每例需观察相应区域100个核异质上皮细胞,计数所有异常信号的细胞数目,计数结果均由两名技术人员分别完成。正常人尿路上皮细胞核为2个红色信号点和2个绿色信号。尿路上皮细胞核出现红色或绿色信号数>2个,则认为该信号出现了扩增,但将4倍体排除在外;尿路上皮细胞核出现红色或绿色信号数为1个或0个,认为染色体单倍体(p16基因杂合子缺失)或p16基因纯合子缺失。本研究以各单染色体拷贝异常细胞数>30个为大量异常。

1.2.3尿脱落细胞学检测 患者留取适量晨尿样本送我院细胞学室检查,连续送检3天。由至少2名高年资病理科医师完成阅片及最终诊断。

1.2.4组织学检查 手术切除或经内镜留取活组织标本,由至少2名高年资病理科医师完成阅片及最终诊断。

2 结果

2.1 临床特征5例患者均为男性,年龄41～61岁,平均54岁。所有患者均出现无明显诱因的无痛性肉眼血尿,时间长短不一,从数天到数月(表1)。1例患者有腰痛。2例患者尿沉渣检测无异常。5例患者影像学(包括泌尿系超声、CT、MRI-肾平扫+增强)均提示异常：膀胱或肾脏有占位,考虑肿瘤性病变。1例患者既往有肾盂低级别乳头状尿路上皮癌病史。

表1 5例尿液FISH单染色体拷贝大量异常的临床病理资料

2.2 FISH检测结果特点5例FISH检测结果特点各不相同(图1,表1)：例1显示Ⅰ区红色信号为3倍体,即3号染色体扩增,异常细胞数32个,其它无异常;例2显示Ⅱ区绿色信号为3倍体,即17号染色体扩增,异常细胞数48个,其它无异常;例3显示Ⅱ区绿色信号为5倍体,即17号染色体扩增,异常细胞数56个,其它无异常;例4显示Ⅱ区绿色信号为单倍体,即17号染色体单倍体,异常细胞数67个,其它无异常;例5显示Ⅱ区红色信号为单拷贝,即p16染色体杂合子缺失,异常细胞数61个,其它无异常。

图1 5例尿脱落细胞FISH单染色体拷贝大量异常：例1为Ⅰ区3号染色体3倍体扩增;例2为Ⅱ区17号染色体3倍体扩增;例3为Ⅱ区17号染色体5倍体扩增;例4为Ⅱ区17号染色体单倍体;例5为Ⅱ区p16基因杂合子缺失

2.3 尿脱落细胞学检测尿液脱落细胞学检测结果显示：3例为癌细胞,1例为重度核异质细胞,1例为分化尚好的尿路上皮细胞及淋巴细胞(图1,表1)。

2.4 组织学检测结果组织学检测结果均为低级别或高级别乳头状尿路上皮癌(图1,表1),1例为肌层浸润性,1例不能明确有无肌层浸润,另3例为非肌层浸润性。2例为低级别,3例为高级别;4例肿瘤位于膀胱,1例位于肾盂。

3 讨论

尿路上皮癌是起源于尿路上皮的恶性肿瘤,包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌和尿道癌,以膀胱癌最常见。尿路上皮癌的细胞遗传学和分子改变具有异质性,其染色体结构和数目的改变非常频繁。9号染色体上的杂合性缺失(9p,51%;9q,57%;甚至高达70%)是膀胱癌早期最常见的分子遗传学改变,可见于各阶段和级别的膀胱癌中,在低级别非肌层浸润膀胱癌中更常见。9号染色体p16基因缺失和失活,产生两个拼接产物INK4A和ARF,通过干扰Rb蛋白和TP53基因功能诱导细胞周期阻滞[1]。另外,发现17号染色体上TP53基因突变或功能丧失更利于肌层浸润膀胱癌的发生和发展[2]。

约30%膀胱癌出现3号染色体异常,常与其它染色体异常同时存在,包括染色体易位和数目的异常。3号染色体畸变以多倍体形式为主。本文例1表现为大量细胞的3号染色体三倍体扩增。

本文5例中有3例与17号染色体相关。目前己知17号染色体上包含两个重要基因：抑癌基因TP53和癌基因HER2。因此,尿路上皮癌的17号染色体变异可引起TP53基因功能缺失和HER2基因扩增等表现,从而促进肿瘤的发生[3]。有报道,添加17号染色体多倍体/HER2扩增状态能提高欧洲泌尿学协会(EAU)非肌层浸润性膀胱癌危险分层表的预测准确性[4]。也有文献报道传统尿路上皮癌易发生17号染色体多倍体和p16基因缺失,而浸润性膀胱微乳头型尿路上皮癌更易发生p16基因的扩增[5]。另有文献报道认为17号染色体数目异常与浅表性膀胱癌复发有关,可作为浅表性膀胱癌复发的预测指标。值得注意的是,其中6例17号染色体单倍体的患者全部复发[6]。因为17号染色体单倍体可能意味着位于17p13的重要的抑癌基因TP53存在缺失,膀胱癌复发概率高。本文例4既往有肾盂低级别乳头状尿路上皮癌病史,此次复发尿FISH结果仅表现为17号染色体单倍体。这提示使用尿FISH监测膀胱癌时发现大量17号染色体单倍体,应告知患者复发的可能性极大。

例5尿FISH检测结果显示p16基因大量细胞杂合子缺失,但目前尚不清楚丢失1个等位基因会如何影响尿路上皮癌的发生。有一种可能是：1个等位基因的丢失,与突变或高甲基化的另1个等位基因结合在一起,此时p16基因功能已完全丧失,但不能被检测为纯合子缺失。因此,p16基因大量杂合子缺失也可能是膀胱癌的指标,但这种情况并不常见[9]。

目前,尿脱落细胞FISH检测推荐的阳性诊断标准是计数25个形态异常细胞：≥4个细胞出现2种染色体多倍体;≥4个细胞出现1种染色体多倍体,合并p16基因>12个细胞出现纯合子缺失。有文献提出下列两种情况也应报告为阳性：同一种染色体存在2种及2种以上异常信号模式(信号点数目,如3个信号点、5个信号点都存在),且每一种异常信号模式细胞数≥4个;p16基因的杂合子缺失≥15%与3、7、17染色体中的1个染色体多倍体≥10%[8]。有实验室自建阈值,通过计数3、7、17号染色体异常和p16基因缺失的细胞数,并计算出相应异常细胞数所占百分比,根据公式[阈值=平均值(M)+3×标准差(SD)]计算出正常人的阈值[9]。然而,对于尿脱落细胞FISH单染色体拷贝大量异常该如何处理,各文献报道不一。有文献建议结合细胞学进行评判[8],也有建议归为疑似阳性[10],但大多数文献未提及此或直接判为阴性[9,11]。

虽然目前FISH检测的敏感性高于脱落细胞学,但对低级别尿路上皮癌的敏感性较低[12]。一项研究显示FISH检测对低、高级别膀胱癌的敏感性分别为82.6%和90.1%[9]。另一研究表明尿FISH检测高级别肿瘤的敏感性为75.6%、特异性为84.8%,低级别肿瘤的敏感性为40.8%、特异性为87.8%[11]。本文5例均经组织病理证实为尿路上皮癌,虽然样本数较少,但也提示不应忽略大量细胞FISH单染色体拷贝异常的病例。因此,将这些病例归入可疑阳性较为合适,从而提高尿FISH检测的敏感性,使患者获益。在计数25个形态异形细胞后,如为可疑病例,应扩大计数至100个形态异形细胞。结合文献[10]及本研究,对可疑阳性判读补充如下：2～3个细胞出现≥2种染色体多倍体(4倍体除外);≥10个细胞出现3、7、17染色体中的1个染色体多倍体(4倍体除外)扩增或所有信号均为4倍体;≥30个细胞出现17号染色体单倍体缺失;≥30个细胞p16基因杂合子缺失。此时,应该建议患者进一步检查。

综上所述,尿FISH检测具有易操作、无创、可靠以及较高的敏感性和特异性等优点,但尿FISH检测低级别尿路上皮癌的敏感性较高级别肿瘤低很多。因此,在实际工作中不应忽视一些特殊的染色体异常,以提高FISH检测的敏感性。未来随着这些病例数的增加,可能会帮助我们对尿FISH和尿路上皮癌有新的认识,从而进一步提高尿FISH的敏感性和特异性,降低医疗成本。