细胞焦亡及其在神经病理性疼痛中作用的研究进展*

田 胜 吴 伟

（南昌大学第二附属医院神经内科，南昌 330006）

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是由躯体神经系统损伤或疾病引起的一种复杂的慢性疼痛，主要表现为自发性疼痛、触诱发性疼痛、痛觉过敏和感觉异常等特点[1]。NP 也是最难治疗的神经系统疾病之一，其患病率为3.3%～8.2%，我国目前NP 病人高达9000 万[2]。长期的疼痛严重影响病人的生活质量，且易合并睡眠障碍、焦虑、抑郁等疾病，给病人家庭及社会带来极大的经济负担。中枢敏化和外周敏化共同参与NP 的发生发展，其中神经元过度兴奋以及神经免疫细胞的功能失调改变了伤害性信号的传导和处理，最终导致痛阈降低[3]。然而，目前的治疗方法仅能缓解病人的疼痛症状，未能从NP 的病理机制上解决疼痛问题。因此，探究NP 发生发展的分子机制，不仅有利于加深对疼痛本质的认识，也对疼痛病人的临床诊治具有极其重要的意义。

细胞死亡普遍存在于多种病理生理过程中，细胞死亡形式主要包括细胞凋亡、铁死亡、细胞坏死、内源性死亡、坏死性凋亡等。除坏死与凋亡两种常见的死亡形式外，随着研究的不断发展，细胞焦亡也引起了广泛的关注，不同于其他细胞死亡形式，细胞焦亡是一种由核苷酸结合寡聚域样受体(NODlike receptor, NLR)炎症小体介导的促炎性程序性细胞死亡方式，表现为细胞持续肿胀直至细胞膜破裂，导致细胞内大量促炎因子的释放进而引起强烈的炎症反应。近年来研究发现，细胞焦亡在NP 发展中扮演重要角色，其机制可能是通过炎症反应诱导神经元致敏，以及影响神经损伤修复和神经元突触可塑性[4]。因此，积极探讨NP 中诱发细胞焦亡的分子机制，从而抑制细胞焦亡过程可能是疼痛相关疾病一种有效的治疗策略。但目前关于细胞焦亡在NP 中作用的相关研究比较分散，缺少系统性的综述。基于此，本文就近年来细胞焦亡在NP 中的研究进展进行综述，为深入了解NP 的分子机制提供新见解，为未来镇痛药物研发提供新方向。

一、细胞焦亡的激活因素

1.K+外流

K+外流已经被确定为NLRP3 炎症小体激活的一个常见因素。Perregaux 等[5]首次报道了钾离子诱导脂多糖处理后的小鼠巨噬细胞中Pro-IL-1β 的成熟。研究发现，P2X7R 是一种由钾离子为载体和三磷酸腺苷介导的配体门控离子通道，可通过K+外流来激活炎症小体的组装，并激活Caspase-1 放大促炎信号[6]。在糖尿病小鼠牙周炎模型和脂多糖处理的巨噬细胞模型中，过表达P2X7R 通过K+外流增加细胞膜的通透性，增加细胞焦亡的发生[7]。随后的研究进一步证明了K+外流在激活NLRP3 炎症小体过程中的重要性。Pétrilli 等[8]研究表明，细胞外高浓度的K+可抑制NLRP3 炎症小体的活化，但不能抑制AIM2 或NLRC4 的活化。因此，有理由推测，K+大量外流导致细胞内钾离子浓度过低可能是介导NLRP3 炎症小体激活的原因。

2.钙离子信号

Feldmeyer 等[9]报道，Ca2+螯合剂 BAPTA-AM可以抑制IL-1β 的分泌，表明Ca2+信号可能参与了NLRP3 炎症小体的激活。当NLRP3 炎症小体被激活时，NLRP3 活化会导致Ca2+动员。而抑制Ca2+信号只能阻断NLRP3 炎症小体的激活，对AIM2和NLRC4 炎症小体的激活却没有明显影响。内质网(endoplasmic reticulum, ER) 是一个重要的Ca2+储存库，对NLRP3 的活化至关重要。药物抑制或敲除ER 中的1, 4, 5-三磷酸肌醇受体(inositol 1, 4,5-triphosphate receptor, IP3R)可以减少Ca2+的动员并抑制NLRP3 的激活[10]。这些研究结果表明ER在NLRP3 激活机制中的关键作用。根据Lee 等[10]的研究，Ca2+动员和NLRP3 的激活是由G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor, GPCR)和钙传感受体(calcium-sensing receptor, CASR)引发的。然而，最近的研究发现，NLRP3 炎症小体的激活可能并不需要Ca2+信号[11]。因此，关于Ca2+信号在NLRP3激活中的主要功能尚需进一步研究。

3.活性氧和线粒体功能失调

关于活性氧(reactive oxygen species, ROS) 和线粒体功能对激活NLRP3 炎症小体的作用，长期以来一直存在争议。根据药学抑制剂相关研究，NADPH 氧化酶催化产生的细胞质ROS 以前被认为是NLRP3 炎症小体激活的常见信号[12]。然而，在缺乏NADPH 氧化酶的小鼠巨噬细胞和人类外周血单核细胞中，可以观察到NLRP3 炎症小体的非典型激活。此外，破坏线粒体功能会促进NLRP3 炎症小体的激活。同时，研究发现ROS 抑制剂会影响NLRP3 激活的起始阶段。进一步研究表明，抑制ROS 可阻止IL-18/1β 的分泌和Caspase-1 的激活。Bae 等[13]观察到，氧化还原条件的变化会使NLRP3 的PYD 结构域和核苷酸结合位点之间的二硫键结构受到影响。这一结果表明，ROS 可通过影响二硫键来激活NLRP3 炎症小体。不过，线粒体功能失调在激活NLRP3 炎症小体过程中的确切分子机制尚不清楚。然而，目前多认为ROS 可能是引发细胞焦亡和NLRP3 激活的关键因素，具体机制尚需进一步探索。

4.溶酶体渗漏

既往一项研究表明当细胞颗粒碎片破坏溶酶体膜并将组织蛋白酶B 释放到细胞质时，NLRP3 炎症小体就会被激活[14]。此外，吞噬的晶体会诱导溶酶体损伤，释放半胱氨酸蛋白酶B (cysteine cathepsin B,CTSB)，进而激活NLRP3 炎症小体。进一步研究发现，NLRP3 炎症小体的激活并非是由于晶体的存在所致，而是溶酶体膜破裂所致。Wang 等[15]的研究表明，CTSB 的缺失会显著抑制NLRP3 的激活。并且，CTSB 抑制剂CA-074-Me 可通过阻断多种组织蛋白酶来抑制 NLRP3 的活化。

二、细胞焦亡的分子途径

细胞焦亡又称细胞炎性坏死，形态学特征主要表现为细胞膜上形成2 nm 左右的小孔，导致胞内钾离子外流造成细胞逐渐胀大至胞膜破裂，进而细胞内容物释放到胞外，引起免疫细胞浸润以及周围细胞的炎症反应，最终加重组织的损伤[16]。一般来说，根据不同的Caspase 分子类型和刺激信号，将依赖于Caspase-1 的分子途径称为经典细胞焦亡途径；而Caspase-1 非依赖的分子途径则是由人类的Caspase-4 和Caspase-5 或小鼠的Caspase-11 诱导，称为非经典细胞焦亡途径。

在经典细胞焦亡途径中，一系列炎症小体识别受体和Caspase-1 的激活会诱发细胞焦亡的发生。炎症小体通常由NLR 家族的上游传感器蛋白、包含PYD 和CARD 结构域的衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptotic speck-like protein containing a caspase recruitment domain, ASC)以及下游效应蛋白Caspase-1组成。传感器蛋白，如模式识别受体 (pattern recognition receptors, PRRs)，可被病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)或损害相关分子模式 (damage-associated molecular patterns, DAMPs)激活形成不同的炎症小体。目前只有NLRP1、NLRP3、NLRC4、Pyrin 和AIM2 能够直接组装炎症小体并激活Caspase-1[17～21]（见表1）。NLRP3 炎症小体是研究最广泛且与细胞焦亡关系最为密切。研究表明，炎症小体在与NP 相关的细胞焦亡和炎症过程中起着至关重要的作用。例如，在大鼠NP 模型中，经吗啡治疗后可介导NLRP3 炎症小体的激活，加重大鼠的疼痛症状。但可通过调节脊髓胶质细胞中的硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxininteracting protein, TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)轴调控NP 的发生发展[22]。在炎症小体激活后，这些传感器蛋白与衔接蛋白ASC 相互作用，通过Pro-Caspase-1 的募集和切割，进而激活Caspase-1。活化的Caspase-1，一方面切割消皮素 D (gasdermin D,GSDMD)，形成 GSDMD 的N 末端和C 末端，活性N 端特异性结合细胞膜上的脂质，进而形成大量的蛋白孔洞，导致细胞渗透压发生变化，引起细胞肿胀并最终破裂，最终诱发细胞焦亡；另一方面促进IL-1β、IL-18 成熟并释放到细胞外，引发炎症反应[23]（见图1）。

图1 细胞焦亡的分子途径

表1 不同类型炎症小体的特征

在非经典细胞焦亡途径中，Caspase4/5/11 可直接结合细菌内脂多糖，切割GSDMD 蛋白而诱发细胞焦亡[24]。并且，GSDMD 的N 末端片段还会激活NLRP3 炎症小体并促进依赖于Caspase-1分子途径中的IL-1β 和IL-18 的成熟。其发生机制为GSDMD 介导的钾离子外流以及产生的线粒体ROS，可进一步激活NLRP3 炎症小体，而不依赖于经典途径中的NLRP3、ASC 和Caspase-1。此外，Caspase-8 的激活被认为属于非经典细胞焦亡途径。在缺乏 Caspase-1 的细胞中，NLRP3 通过建立一个Caspase-8 激活平台，进而切割Pro-IL-1β，最终诱导细胞焦亡[25]。因此，不依赖于Caspase-1的Caspase 蛋白激活途径属于一种非经典途径。目前有学者认为，Caspase-3 是外源性和内源性凋亡的执行蛋白，并且有文献报道Caspase-3 通过切割GSDME 也能引起细胞膜破裂，进而诱导细胞焦亡，表明细胞凋亡和细胞焦亡不仅会竞争性诱导细胞死亡，还可能同时发生，一起介导细胞程序性死亡[26]（见图1）。

三、细胞焦亡与NP

炎症反应在NP 的发生发展中起着至关重要的作用。在神经损伤初期，炎症对于促进神经再生和愈合是必不可少的。然而，当炎症反应消退过程受到破坏后，会介导慢性疼痛的形成。此外，细胞焦亡是通过炎症小体的激活并介导的炎症性细胞死亡。

最近研究表明，在小鼠NP 模型中，NLRP3 炎症小体的激活显著增强，以及细胞焦亡相关蛋白（如IL-1β、IL-18、ASC、Caspase-1 和NLRP3）表达水平也明显升高[27]。并且，坐骨神经功能指数检查显示，NLRP3-KO 小鼠的炎症反应减少，运动功能明显改善，表明细胞焦亡参与了NP 的病理生理过程，其可能是NP 的干预靶点。此外，研究发现NLRP3 炎症小体的激活会加重NP 合并的焦虑和抑郁样症状。而Albiflorin 制剂可以通过促进Nrf2 核易位和阻断NF-κB 核易位来抑制NLRP3 的表达和激活，从而缓解NP 和情感障碍相关症状[28]。在糖尿病神经病理性疼痛中，Salidroside 可抑制背根神经节中NLRP3 炎症小体的激活，进而缓解NP[29]。在高脂肪饮食诱导的糖尿病前期神经病变小鼠模型，以及棕榈酸盐处理的小鼠背根神经节神经元中，研究者观察到NLRP3 炎症小体明显激活，以及背根神经节中IL-1β 表达上调[30]。Cheng 等[31]研究发现，在2 型糖尿病小鼠和疼痛性神经病变大鼠模型的背根神经节中NLRP3 的表达水平显著升高，这与既往的研究结果一致；进一步研究发现经高糖处理的施万细胞可以促进NLRP3 炎症小体的活化、IL-1β和IL-18的成熟以及GSDMD裂解水平的升高，表明细胞焦亡明显增加。

大量研究表明，免疫机制介导的炎症性疾病与NP 存在因果关系。Wang 等[32]发现，褪黑素可抑制NF-κB/NLRP3 依赖性信号传导，从而调控细胞焦亡以缓解NP。为了研究褪黑素与细胞焦亡之间可能存在的联系，该研究人员建立了大鼠脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)模型。研究表明，SNL 术后的疼痛异常，可能是通过 NLRP3 和 NF-κB信号激活后，显著上调的细胞炎性因子介导的。而使用小分子药物抑制NLRP3 后，SNL 大鼠的疼痛程度及炎症水平均显著降低。这说明细胞焦亡的发生可能在介导NP 的病理机制中发挥重要作用。综上所述，NP 可诱导细胞焦亡的发生，出现炎症小体的活化和细胞焦亡相关蛋白的上调，靶向干预炎症小体NLRP3/Caspase-1 介导的细胞焦亡，能缓解炎症反应，是缓解疼痛的有效策略，可为NP 的治疗提供新的思路。

四、细胞焦亡作为潜在的NP 治疗靶点

1.NLRP3 炎症小体抑制剂

由于炎症小体可检测到各种DAMP 和PAMP并诱导促炎性Caspase 的生理活性，所以炎症小体被认为是细胞焦亡的催化剂和重要参与者。因此，调控炎症小体的组装和活化可以抑制细胞焦亡及其导致的细胞功能障碍。

目前研究的热点是对外来刺激产生反应的NLRP3炎症小体及其上游信号通路。NF-κB 信号通路是NLRP3 炎症小体激活的必要条件。因此，首选的治疗方法是防止NF-κB 通路被激活，以抑制细胞焦亡的发生。天然合成的褪黑素具有强大的抗炎特性，可预防各种炎症疾病。此外，褪黑素通过调控NF-κB受体，可以显著促进NF-κB 向细胞核转位。在SNL模型中，褪黑素已经被证实通过调控NF-κB/NLRP3炎症小体轴，从而抑制细胞焦亡，缓解NP[32]。Sun等[33]证实，金麦通通过抑制NLRP3 炎症小体和细胞焦亡，最终缓解NP 动物模型的行为学表现和形态学损伤。鉴于NLRP3 在细胞焦亡过程中的关键作用，亟需开发更多的NLRP3 分子抑制剂。

2.Caspase-1 抑制剂

Caspase-1 对GSDMD、IL-1β 和IL-18 的活化至关重要。目前主要报道了两种靶向Caspase-1 的药物，如vx-740 (Pralnacasan)和vx-765。小分子Caspase-1抑制剂vx-765和vx-740 (Pralnacasan)是拟肽类药物，经血浆酯酶代谢后，分别活化为VRT-043198 和VRT-18858，其中vx-765 是一种可逆性的Caspase-1抑制剂，也是目前最多用于治疗NP 的Caspase-1抑制剂[34]。目前这类药物用于治疗癫痫和银屑病的II 期临床研究已经完成。进一步研究表明，口服Caspase-1 抑制剂vx-765 后可以有效缓解SNL 动物模型的疼痛症状。此外，与褪黑素一样，vx-765也能抑制SNL 模型中Caspase-1、NLRP3、ASC 和GSDMD 的表达上调[35]。因此，这些研究结果为使用Caspase-1 抑制剂治疗NP 提供了理论基础。

3.Gsdmd 抑制剂

Gasdermin 家族蛋白，尤其是GSDMD 在细胞焦亡过程中承担着执行者和整合来自炎症小体的多种内源性和外源性信号的关键作用[36]。一旦GSDMD诱导的细胞穿孔无法正常形成，大多数活化的炎症小体、Caspase 和生物分子信号将会被阻断。因此，抑制GSDMD 诱发的细胞焦亡可间接抑制后续的炎症级联反应，阻断细胞焦亡所产生的一系列不良反应。目前针对性抑制GSDMD 的药物可分为两类：①抑制促炎性Caspases-1 活化GSDMD；②阻断GSDMD-NT 的寡聚化或细胞膜插入。双硫仑是美国医师最常使用的戒酒药物，用于治疗酒精依赖症。研究发现，双硫仑通过靶向GSDMD 上的Cys191结构域，抑制GSDMD 诱导的细胞膜穿孔，从而抑制了细胞焦亡和IL-1β/18 的释放[37]。进一步研究表明，小分子化合物Necrosulfonamide 可与裂解的GSDMD 相互作用，阻断p30-GSDMD 片段的寡聚化，并抑制细胞膜穿孔的形成。此外，Yang 等[38]揭示了GSDMD 与Caspase-1/4/5/11 相互作用的裂解位点，并合成了GSDMD 衍生抑制剂(Ac-FLTD-CMK)，而该抑制剂可以代替全长的GSDMD，并与上述Caspase 分子结合，从而阻断GSDMD 的裂解活化。

4.细胞因子抑制剂

IL-1β 和IL-18 在细胞焦亡过程中具有重要作用，并参与NP 的发生发展，可能是NP 的另一个潜在治疗靶点。尽管Canakinumab 通过抑制IL-1β和IL-18 信号已被证明对心血管疾病有治疗作用，但针对这一信号的药物在治疗NP 方面仍需进一步验证[39]。最初，研究者发现乳铁蛋白是胃蛋白酶分解乳铁蛋白时产生的一种抗菌肽。目前研究表明，乳铁蛋白能明显减少由分解代谢因子（IL-1β、IL-18 和IL-6）引起的氧化因子和炎症因子的分泌[40]。然而，这些药物在治疗NP 方面的疗效仍需进一步探索。

五、总结与展望

NP 的发病机制涉及多因素、多环节交联的信号转导过程，本文综述了细胞焦亡及其在NP 中的可能作用机制，并分别讨论了引发细胞焦亡的多种因素，以及部分分子抑制剂应用于NP 防治的细胞焦亡相关机制。细胞死亡方式（如细胞凋亡、细胞焦亡、铁死亡）的多样性可能是NP 治疗效果不令人满意的原因之一。尽管许多研究已经证实了细胞焦亡在NP 中的关键作用，但仍不能确定它是否是一个主要因素。目前关于细胞焦亡的相关机制尚不明确，特别是现已知信号通路的下游信号调控机制尚未阐明。并且对于药物抑制剂在临床试验中的有效性及安全性还有待证明。到目前为止，尚无一种细胞焦亡的抑制剂被批准用于NP 的临床应用。因此，未来迫切需要更多的基础研究深入地探索细胞焦亡在NP 中的作用机制，以及更多大型临床随机对照试验验证细胞焦亡相关分子抑制剂的有效性及安全性。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。