奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis) MR-1对氟西汀降解过程的转录组及功能基因分析

万 宇,杭小帅,王志刚,张 澜①,周 莉,尤晓慧,朱冬冬,王 燕,肖 静,陈 翔

(1.扬州大学环境科学与工程学院,江苏 扬州 225009;2.生态环境部南京环境科学研究所,江苏 南京 210042)

抑郁症已成为全球最常见的精神疾病之一,全球抑郁症患者超过3亿人,而中国抑郁症患者超过9 500万人,每年有大量的抗抑郁药在我国被消费[1-2]。氟西汀是我国抑郁症患者最广泛使用的抗抑郁药物之一,但经口服给药后仅有低于10%的剂量被代谢,剩余部分则以母体或代谢产物的形式释放到环境中[3]。在污水处理厂出水中检测到氟西汀的质量浓度高达3 465 ng·L-1[4],进水浓度可能更高。此外,在地表水和饮用水中也检测到了氟西汀[5-6],主要为ng·L-1级别。尽管氟西汀在水体中浓度较低,但由于其较高的靶向生物活性和难以被水中微生物降解的特性,会对水生态系统中的非目标生物和人体健康造成潜在威胁[7-8],如何有效去除污水中的氟西汀成为研究关注的热点。

微生物降解技术是目前污水处理的常用技术之一,因其工艺简单、处理成本低和易规模化的优点而被广泛应用[9],其中异化金属还原菌可以在厌氧或缺氧条件下以金属铁、锰等氧化物作为最终电子受体将其还原为低价态的金属离子,这一过程可偶联多种有机物的氧化,加速其在环境中的迁移转化,因而在环境污染修复领域中具有巨大的潜在应用价值[10-12]。ShewanellaoneidensisMR-1作为典型的异化金属还原菌株之一,在厌氧条件下利用Fe3+作为末端电子受体,通过氧化电子供体对多种有机污染物进行降解[13-14]。目前,关于ShewanellaoneidensisMR-1胞外电子传递机制的研究已有不少报道。HE等[15]研究了ShewanellaoneidensisMR-1降解硝基芳香族化合物,发现其降解过程中电子传递效的存在率主要依赖c-型细胞色素家族基因cymA和硝基还原酶基因nfnB的表达。近年来,微生物组学如蛋白组学、转录组学分析已被用于探索微生物降解途径[16-18]。其中,转录组学可以从基因水平上探索微生物降解途径。CAO等[17]基于转录组技术分析了ShewanellaoneidensisMR-1降解甲基橙的机理,发现三羧酸循环、氨基酸生物降解和电子转移系统的基因表达水平在甲基橙的影响下被显著改变。但是目前从转录组学的角度分析ShewanellaoneidensisMR-1降解抗抑郁药的研究相对较少。

笔者研究了ShewanellaoneidensisMR-1厌氧还原降解氟西汀的性能,并采用转录组学技术从水平层面分析ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀的作用机制,为ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀的功能基因和降解机理提供了基础数据,同时也为抗抑郁药污染的微生物修复技术提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

ShewanellaoneidensisMR-1:来自中国科学院南京土壤研究所实验室。

主要试剂:氟西汀盐酸盐、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、蛋白胨、酵母提取物、琼脂、无水氯化铁、柠檬酸三钠、乳酸钠、甲醇、邻菲罗啉、乙酸铵、冰乙酸,均购自上海市阿拉丁化学试剂有限公司,所有化学试剂皆为分析纯。

主要仪器:紫外分光光度计(岛津UV2700)、高效液相色谱(安捷伦1260)。

1.2 培养基的配置

LB培养基(1 L):10 g NaCl、10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、15 g琼脂粉(配制固体培养基时加入)。

无机盐培养基(1 L):0.46 g NaCl、0.23 g K2HPO4、0.23 g KH2PO4、0.12 g MgSO4·7H2O、0.23 g (NH3)2SO4、11.91 g HEPES 和微量元素10 mL,用2 mol·L-1NaOH调节pH值至7。

1.3 氟西汀降解实验

将40 mL加入含柠檬酸铁的无机盐培养基转移至100 mL盐水瓶中,使用橡胶塞封口,在121 ℃下高温高压灭菌20 min。盐水瓶冷却至室温后,通氮气30 min以去除溶液中的氧气,加入氟西汀溶液、乳酸钠溶液和菌液,再使用灭菌的无机盐培养基定容到50 mL。将盐水瓶放入 30 ℃水浴锅中,使用氮气持续曝气进行氟西汀降解实验,定期从盐水瓶中取样分析测定。每组实验设置3个平行样,取3个平行样的平均值作为实验结果。实验组反应体系的菌体浓度OD600为0.50,乳酸钠浓度为10 mmol·L-1,Fe3+浓度为10 mmol·L-1,氟西汀浓度为4 mg·L-1。质控组不添加细菌,其余条件与实验组一致。灭活菌组将等量细菌经高压灭活后添加到4 mg·L-1氟西汀的培养基中,其余条件均与实验组反应体系一致。对照组(CK)不添加氟西汀,其余条件均与实验组反应体系一致。

1.4 氟西汀的浓度测定

使用一次性无菌注射器在降解2、4、6、8、10、12 h时取样,吸取溶液0.20 mL,于10 000 r·min-1离心10 min后(离心半径为6 cm)使用0.22 μm孔径水系滤膜过滤,用高效液相色谱进行分析测定。色谱柱为C18 色谱柱(15 μm , 4.5 mm × l5 mm),流动相为v(甲醇)∶v(0.05 mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液)=55∶45,流速为1 mL·min-1,检测波长为230 nm,柱温为30 ℃,检测器为二极管阵列。

1.5 提取总核糖核酸(RNA)与建库测序

对于培养4 h后的菌株(每组3个平行),在4 ℃、10 000 r·min-1条件下离心10 min(离心半径为6 cm)收集菌体。RNA采用TRIzol(Invitrogen)法提取,利用Nanodrop 2000对RNA浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent 2100测定RNA完整性数值(RIN)。单次建库要求RNA总量≥1 μg,ρ≥35 ng·μL-1,OD260/280≥1.80,OD260/230≥1.0。

对于试验组和对照组的RNA(每组3个平行)进行建库测序,RNA测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。使用TruSeqTM RNA试剂盒(Illumina,美国)构建转录组文库,使用Illumina HiSeq X Ten(2×150bp)进行RNA-seq双端测序。对原始数据进行质量剪切,得到高质量的处理后数据(clean data)。每个样本中的高质量测序片段(reads)比对已经注释的参考基因组,获得用于后续分析的数据匹配,同时对此次测序的比对结果进行质量评估。ShewanellaoneidensisMR-1参考基因组为NC_004347(GenBank accession)。

1.6 差异表达分析与功能富集

利用每百万测序量匹配到该基因每千个碱基的单端片段的数量(transcripts per million reads,TPM)来计算实验组和对照组的基因表达量,分析识别实验组和对照组之间的差异表达基因。在获得差异表达基因的表达量水平后,利用DESeq2对不同试验组间基因差异表达进行数据分析。通过基因本体数据库(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)进行注释分析和显著性富集分析,确定差异表达基因主要行使的生物学功能及参与氟西汀降解的生化代谢途径,从而推测ShewanellaoneidensisMR-1耐受和降解氟西汀的分子机理。

2 结果与分析

2.1 Shewanella oneidensis MR-1降解氟西汀的特性

由图1可以看出,ShewanellaoneidensisMR-1对体系中氟西汀的降解率随时间增加而增加,氟西汀浓度在0～4 h快速下降,4 h降解率达78.51%,降解速率为0.94 mg·L-1·h-1;6～12 h氟西汀的降解速率逐渐减小,12 h降解率达93.12%。实验组ShewanellaoneidensisMR-1对氟西汀的去除率都显著高于空白不加菌的质控组(P<0.01),说明氟西汀的去除主要依赖于ShewanellaoneidensisMR-1的厌氧降解作用。灭活菌组菌体对氟西汀的去除率约为11%,说明菌体对氟西汀具有一定的吸附作用。因此,ShewanellaoneidensisMR-1对氟西汀的去除主要依赖于降解作用,吸附作用贡献较小。

实验组反应体系的菌体浓度OD600=0.50,乳酸钠浓度为10 mmol·L-1、Fe3+浓度为10 mmol·L-1,氟西汀浓度为4 mg·L-1;质控组不添加细菌,灭活菌组添加等量灭活细菌,其余条件与实验组一致。

2.2 Shewanella oneidensis MR-1在降解氟西汀后的转录组学分析

利用Illumina Hiseq高通量测序平台对降解氟西汀后的菌株进行转录组学测序,表1统计了本次转录组原始产出数据和进行质量控制后的数据。碱基质量值反映了识别碱基的数据精确性,碱基质量值(Q)越高,说明测序错误率越低,一般认为Q>20即在可接受范围。由表1数据可知,对照组和实验组的Q值基本在20以上,对照组占了97.94%,A组占了97.79%。所以此次的测序数据质量较好,达到后续基因分析要求。

表1 数据统计

2.2.1基因差异表达分析

根据P<0.05与|lgCF|≥2(CF为差异倍数)的原则来筛选ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后与对照(不含氟西汀)之间的差异表达基因。图2是ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后实验组与对照组转录组数据的差异表达基因分布。在降解氟西汀后,ShewanellaoneidensisMR-1共获得4 797 个差异表达基因,其中2 255个基因显著上调,2 368个基因显著下调。该结果说明,氟西汀在降解过程中改变了ShewanellaoneidensisMR-1的基因表达,菌株可以通过上调或下调部分基因来应对氟西汀的刺激,维持细胞正常生长。

P′为校正P值,CF为差异倍数。数据点越靠近左上角或右上角表示下调或上调越显著。

2.2.2差异表达基因GO功能分析

为进一步揭示ShewanellaoneidensisMR-1对氟西汀代谢的功能响应,对氟西汀处理组和对照组之间的差异表达基因进行了GO注释和富集分析。通过GO功能分析,可得到差异表达基因显著富集的GO 通路,确定差异表达基因与生物学功能的关系。GO数据库将基因的功能分为3大类:生物学过程(biological process)、分子功能(molecular function)和细胞组分(cellular component)。选取最显著富集的20个GO 通路进行注释分析(图3),根据差异表达基因的GO注释分析结果发现,参与生物学过程、细胞组分和分子功能的差异表达基因比例依次为4.68%、53.07%和42.25%。差异表达基因数量最多的GO 通路属于细胞组分和分子功能。其中在细胞组分类别中与细胞膜的组成部分有关的差异表达基因最多(311个)。分子功能分类中基因数目最多的差异表达基因与ATP结合、DNA结合和金属离子结合有关,分别含有94、93、93个表达基因,这些基因与电子的跨膜运输有关。

GO的二级分类

选取最显著富集的20个GO 通路进行富集分析,由图4可知,上述GO通路主要富集到氨基酸代谢和有机酸代谢相关的通路,其中有机酸代谢过程(organic acid metabolic process)、小分子代谢过程(small molecule catabolic process)和羧酸代谢过程(carboxylic acid catabolic process)可能与氟西汀的降解有关。

图4 基因本体数据库(GO)富集分析

2.2.3差异表达基因KEGG功能分析

KEGG数据库一般用来描述细菌代谢通路,通过比对KEGG数据库可以探索微生物体内各种物质的代谢过程。因此,KEGG数据库中丰富的通路信息有助于从系统水平研究基因的生物学功能。KEGG富集分析能够确定差异表达基因所参与的生物学功能,其中富集到的有4大类代谢通路:代谢(M)、细胞过程(CP)、遗传信息处理(GIP)和环境信息处理(EIP)。图5为实验组与对照组差异表达基因的KEGG通路注释分析,4大代谢通路的差异表达基因所占比例分别为63.33%(代谢)、13.90%(细胞过程)、6.95%(遗传信息处理)和15.82%(环境信息处理)。图5展示了与耐受和降解氟西汀有关的通路,其中差异表达基因数量最多的KEGG通路属于代谢(M)。代谢通路中差异表达基因最多的与氨基酸代谢(amino acid metabolism)有关,含有117个差异表达基因。并且像代谢(M)中碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)、辅因子和维生素的代谢(metabolism of cofactors and vitamins)、能量代谢(energy metabolism)的基因也有较多的表达,分别含有54、79、56个表达基因,这说明氟西汀的降解需要细菌进行正常的生命活动提供能量。遗传信息处理(GIP)和环境信息处理(EIP)中的细胞运动(cell motility)和膜转运(membrane transport)较多基因的表达也说明氟西汀降解需要跨膜的能量传递过程。

图5 京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)注释分析

选取最显著富集的9个KEGG通路进行分析(图6),在代谢通路中除了富集到氨基酸合成和代谢相关通路外,还富集到二元酸代谢(C5-Branched dibasic acid metabolism)、丙酸代谢(Propanoate metabolism)等小分子有机酸代谢的通路。这些通路反映了ShewanellaoneidensisMR-1相关基因可能在耐受和降解氟西汀方面发挥功能。

图6 京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)富集分析

2.2.4与耐受相关的功能基因分析

通过对氟西汀处理后ShewanellaoneidensisMR-1的转录组分析,发现一些显著上调的基因与菌株的耐性有关(表2)。表2列出了12个与菌株耐受作用相关的基因,与应激相关的基因中包膜应激反应膜蛋白基因、毒素-抗毒素体系基因、氧化应激防御蛋白高表达且显著性上调。其中氧化应激防御蛋白基因显著上调13.37倍(P<0.01),且高表达(TPM值=910.48);包膜应激反应膜蛋白基因均高表达,包膜应激反应膜蛋白PspB基因和PspC基因的表达量分别为2 392.20和3 598.60(TPM)。另外,与细胞膜组成相关,可以保护细菌的细胞膜结构的噬菌体休克蛋白PspA基因、ABC转运蛋白基因、外膜蛋白组装因子基因均显著上调且高表达。噬菌体休克蛋白PspA基因表达量高达5 594.62,上调倍数为4.58倍(P<0.01);ABC转运蛋白基因表达量为530.07,上调倍数最高为11.64倍(P<0.01);外膜蛋白组装因子基因表达量最高为344.29,上调倍数为3.44倍(P<0.01)。这些基因的表达量显著性上调,说明在ShewanellaoneidensisMR-对氟西汀的耐受中发挥了重要的作用。

表2 Shewanella oneidensis MR-1转录组中部分与氟西汀耐受相关的差异表达基因

2.2.5与降解相关的功能基因分析

表3列出了高表达且差异倍数大于3的基因,这些基因都与氟西汀的降解相关。与氟西汀降解相关的功能基因主要分为调控氧化还原酶和电子传递相关的基因。氧化还原相关的基因中硝基还原酶NfsB基因、丙酮酸脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶Ⅰ基因、厌氧核糖核苷-三磷酸还原酶基因等发生显著上调。其中硝基还原酶NfsB基因表达量为2 572.95,上调倍数达4.85倍(P<0.01);高丝氨酸脱氢酶Ⅰ基因表达量为428,上调倍数高达36.70(P<0.01)。电子传递相关的基因中乳酸利用蛋白基因、细胞色素C基因、细胞色素C基因过氧化物酶基因、细胞色素C成熟蛋白CcmE基因等表达量均显著上调,其中乳酸利用蛋白基因表达量为2 572.95,上调倍数高达43.44倍(P<0.01);细胞色素C基因的表达量上调倍数达12.95倍(P<0.01),高达1 236.11(TPM)。结果表明,调控氧化还原酶和电子传递相关的基因在氟西汀的降解转化中发挥着十分重要的作用。

表3 Shewanella oneidensis MR-1转录组中部分与氟西汀降解相关的差异表达基因

3 讨论

对ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀进行研究,12 h氟西汀的去除率达93.12%,降解速率达0.94 mg·L-1·h-1(图1)。实验结果表明,ShewanellaoneidensisMR-1能够有效降解氟西汀。氟西汀微生物降解主要分为单一菌中降解和微生物群落降解。MOREIRA等[10]探究了LabrysportucalensisF11降解氟西汀的性能,发现其在2 d内可将2 μmol·L-1氟西汀完全降解。PALMA等[9]利用厌氧还原细菌菌落降解氟西汀,结果发现细菌菌落在28 d可以去除体系中69%±12%的氟西汀(20 mg·L-1)。因此,ShewanellaoneidensisMR-1在厌氧条件下对氟西汀的降解更为高效,是一个具有应用前景的微生物处理技术。

ShewanellaoneidensisMR-1的转录组测序结果表明,氟西汀处理条件下的菌株与不添加氟西汀对照组的基因表达有很大的差异,共有2 255个显著上调基因和2 368个显著下调基因(图2),说明在氧化应激条件下ShewanellaoneidensisMR-1体内存在一个自我调节的系统,通过调控一系列基因的表达来适应环境的改变。差异表达基因的GO富集分析显著富集到支链氨基酸异亮氨酸的生物合成与缬氨酸代谢过程(图4);KEGG同样也富集到支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成与代谢通路(图6)。据报道,控制支链氨基酸合成与代谢的基因在清除自由基及增强机体抗氧化能力方面有明显作用,补充支链氨基酸可上调活性氧(ROS)防御系统基因,降低ROS的产生[19,20]。这些支链氨基酸的合成与代谢可能与氟西汀降解转化过程中产生的应激相关。GO富集分析还富集到氧酸、有机酸、羧酸等小分子有机酸的合成与代谢(图4),KEGG同样也富集到丙酸、C5二元酸小分子有机酸的代谢通路(图6)。已有研究证实,小分子有机酸可以加速细菌产生ROS,从而促进芳香族化合物的降解[21]。因此,这些小分子有机酸的合成与代谢可能与氟西汀降解转化相关。转录组分析的结果表明,在ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后出现上调的2 255个表达差异显著的基因中,与支链氨基酸以及小分子有机酸的合成与代谢相关基因是研究细菌耐受和降解氟西汀机理的关键点。此外,GO富集分析结果表明,差异基因富集在细胞膜的组成部分,这可能与氟西汀降解过程中的膜运动相关。氟西汀的降解可分为胞内和胞外作用,一方面,氟西汀可与细胞膜进行相互作用[22],进入胞内被ShewanellaoneidensisMR-1降解;另一方面,ShewanellaoneidensisMR-1对有机污染物的降解和胞外电子传递有关,胞外电子传递过程与细胞膜的跨膜运输相关[23]。

在ShewanellaoneidensisMR-1的应激反应中,与膜蛋白相关的包膜应激反应膜蛋白基因、外膜蛋白组装因子基因和ABC转运蛋白基因显著上调且高表达(P<0.01)(表2),说明菌株可以通过调控细胞膜蛋白基因的表达来应对环境的变化。研究表明,膜蛋白可以保护细菌免受各种环境胁迫,ABC转运蛋白作为最大的膜蛋白家族之一,在研究解毒和耐药性方面具有重要意义[24]。这些控制ABC转运蛋白的相关功能基因发生上调且高表达,说明其在应激反应中发挥了重要的作用。有研究表明,氟化物可以对微生物产生胁迫[25]。微生物可以通过毒素-抗毒素(TA)体系应对产生胁迫的有害化学物质,以维持细菌的正常活动[26]。表2中TA系统的基因明显上调并且高表达,这可能与ShewanellaoneidensisMR-1通过提高调控TA系统功能基因的表达来应对氟化物的胁迫有关。氧化应激蛋白可以增强细菌对氧化环境的耐受能力,保护细胞结构的完整以进行正常的生命活动[27]。表2中氧化应激蛋白基因的表达量明显增加,说明ShewanellaoneidensisMR-1通过提高自身的抗氧化能力应对电子传递过程中产生的ROS。噬菌体休克蛋白在保护细胞膜的功能上发挥了十分重要的作用,一般可以用于消除细胞受损蛋白[28]。实验组中噬菌体休克蛋白基因的表达量显著增加,说明其在ShewanellaoneidensisMR-1应对氟西汀的应激中具有十分重要的作用。

目前推测含氟有机化合物微生物降解的路径主要有加氧、还原、水解、脱氟等[29-30]。KHAN等[31]已经报道了微生物降解氟西汀的路径是将氟西汀转化成4-(三氟甲基)苯酚(TFMP)和3-(甲基氨基)-1-苯基丙烷-1-醇,最终转化为三氟乙酸盐和氟离子。在氟西汀微生物的降解途径中,氧化还原过程是降解的关键步骤之一。ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀后,一些与氧化还原作用相关的基因发生了显著的变化,这可能与降解氟西汀有着密切的联系。在ShewanellaoneidensisMR-1 降解氟西汀过程中,氧化还原相关的基因包括厌氧核糖核苷-三磷酸还原酶基因、蛋氨酸还原酶基因、亚甲基四氢叶酸还原酶基因、高丝氨酸脱氢酶Ⅰ基因、4Fe-4S脱氢酶基因、丙酮酸脱氢酶基因均高表达且显著上调(P<0.01)(表3)。高丝氨酸脱氢酶I、4Fe-4S脱氢酶、丙酮酸脱氢酶都被报道与芳香化合物的微生物降解有关,它们都可以参与污染物的氧化还原反应[32-34]。表3中控制这些酶的基因表达量均有不同程度的增加,说明这些基因都与氟西汀降解转化有关。有研究证明,氟磺胺草醚可以通过硝基还原酶进一步转化降解,因此该研究中硝基还原酶NfsB基因的上调说明该基因在氟西汀的降解中发挥了一定的贡献[22]。实验中采取的电子供体为乳酸钠,由表3可知乳酸利用蛋白基因显著上调且高表达(P<0.01),说明ShewanellaoneidensisMR-1可以利用乳酸钠进行生命活动并产生电子。目前,ShewanellaoneidensisMR-1胞外电子传递途径主要分为直接电子传递和间接电子传递,其中直接电子传递用外膜细胞色素C与胞外电子受体直接接触进行电子转移[35]。因此控制细胞色素C产生的相关基因可以反映电子的传递效率变化。表3中控制细胞色素C产生与代谢相关基因表达均有不同程度的增加,说明在氟西汀降解过程中电子传递的效率明显增加。综上,氧化还原和促进胞外电子传递的相关基因是ShewanellaoneidensisMR-1厌氧降解氟西汀的关键基因。

4 结论

ShewanellaoneidensisMR-1通过胞外电子传递机制可以有效去除氟西汀,12 h氟西汀的去除率达93.12%,降解速率达0.94 mg·L-1·h-1。研究利用转录组技术分析得到ShewanellaoneidensisMR-1对氟西汀刺激以及降解的功能基因。菌株在降解氟西汀后与不添加氟西汀培养菌株的转录组比对中共获得4 797个差异表达基因,说明ShewanellaoneidensisMR-1可以通过基因的上下调来应对氟西汀的刺激,维持细胞正常的生命活动。在差异表达基因的GO和KEGG富集分析中都富集到氧化应激相关的支链氨基酸合成与代谢基因以及与氟西汀降解相关的小分子酸合成与代谢基因。高差异表达基因的筛选结果表明,ShewanellaoneidensisMR-1对氟西汀的应激主要依赖于调控应激反应膜蛋白基因、ABC转运蛋白基因、噬菌体休克蛋白PspA基因,以提高对细菌对于环境的适应能力。ShewanellaoneidensisMR-1对氟西汀的降解主要通过调控氧化还原酶和电子传递相关基因,尤其是细胞色素C基因、硝基还原酶NfsB基因、乳酸利用蛋白基因。研究为ShewanellaoneidensisMR-1降解氟西汀的功能基因和降解机理提供了丰富的基因数据,同时也为抗抑郁药污染的微生物修复技术提供了理论参考。