高速逆流色谱法分离脂肪酸的应用

钟子豪, 兰 鸽, 王镯历, 董 驰, 邹慧文, 白 希

(新疆师范大学化学化工学院,乌鲁木齐 830054)

脂肪酸是人体重要营养成分,在机体生长发育中发挥着特殊的生理学作用。ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸(PUFAs)作为人体必需脂肪酸,显示出良好的抗癌、抗衰老活性[1,2],在维持机体生理平衡上发挥重要作用;羟基不饱和脂肪酸(HUFAs)作为常见的含氧酸,大量存在于发酵食品中并影响其风味[3],具有良好的降糖和抗炎活性[4],并展现出较强的抑菌活性[5],但目前HUFAs的抑菌机理暂不明确,亟需获取高纯度标样进行探究。因此,高纯度脂肪酸的分离已成为食品工业、制药工程以及日用化工行业的研究热点。

目前,分离脂肪酸传统手段有减压蒸馏法、溶剂萃取法、低温结晶法、尿素包合法等,各类脂肪酸分离技术的原理、优缺点及适用范围对比如表1所示。采用传统分离技术纯化脂肪酸虽然简便易行,但仍普遍存在分离纯度低、溶剂消耗量大等缺陷。高速逆流色谱(HSCCC)是一种连续、高效的液-液分配分离技术,基于各化合物在两相溶剂中的分配系数(Partition coefficient, K)差异从而产生分离[12,13]。该方法相较传统分离手段有着样品回收率高、无不可逆吸附、分离程序灵活等特点[14],可满足各类脂肪酸的分离需求。近年来,国内外学者在HSCCC分离脂肪酸的应用方面已取得较大研究进展,如HSCCC分离功能性PUFAs的方法学考察以及分离产物在食品、医药等领域得到应用[15];Simon等[16]侧重对HSCCC仪器构造的改进与洗脱模式的创新;Liang等[17]则聚焦利用HSCCC分离食品和油脂中的HUFAs,以揭示其形成机理和抑菌活性。文章结合近年来国内外研究者的相关工作,从溶剂体系、洗脱模式、检测器及实际样品应用4个方面对HSCCC分离纯化脂肪酸的研究进行综述,以期为优化HSCCC分离脂肪酸工艺条件提供参考。表2整理了近年来HSCCC在分离脂肪酸中的应用。

表1 脂肪酸分离技术比较

表2 高速逆流色谱在分离脂肪酸中的应用

1 高速逆流色谱分离脂肪酸溶剂体系

HSCCC作为液-液分配色谱,溶剂体系的选择尤为重要,合适的K值是高效分离的前提。为使样品在溶剂体系中有较高溶解度并避免产生变性、分解等问题,通常需控制目标产物K值在0.5～2.0区间,若K值过小会导致样品迅速被洗脱,未达到分离目的;而K值过大会浪费大量时间和溶剂,降低分离效率。

1.1 经典溶剂体系

目前HSCCC经典的3种溶剂体系有:由正己烷/乙酸乙酯/甲醇/正丁醇/水组成的Ito体系[40]、正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水组成的Arizona体系[41]以及正庚烷/正丁醇/乙腈/水组成的HBAW体系[42]。表2列举了从各样品中分离脂肪酸所使用的溶剂体系。为获得理想的分离效果,所使用的溶剂体系需要与目标脂肪酸极性匹配,满足“相似相溶原理”。3种经典溶剂体系均采用弱极性与强极性溶剂形成两相溶剂体系,再选择性添加中等极性溶剂加以改善的调配思路。其中弱极性溶剂常采用正己烷、正庚烷作为体系中的脂溶性溶剂,使脂肪酸溶解于其中;而强极性溶剂通常选用甲醇、乙醇、乙腈、水等,用于拓宽溶剂体系分离极性范围;常用的中等极性调节剂有乙酸乙酯、正丁醇等,针对目标脂肪酸的极性选择性添加适量中等极性调节剂,可改善整体溶剂体系极性强度,使样品在溶剂中获得较高溶解度。

3种经典溶剂体系所适用的分离类型有较大差异,这与各体系的溶剂组成有关。Ito体系主要采用强极性的甲醇、乙醇以及水作为调节剂,可有效拓宽分离极性范围,对各类脂肪酸进行有效分离;Arizona体系主要采用中等极性的乙酸乙酯作为调节剂,该体系分离极性范围较窄,适用于极性较小的长链游离脂肪酸(如油酸、亚油酸等)以及羟基脂肪酸的分离;HBAW体系主要采用极性稍弱的乙腈代替水作为强极性溶剂,故其分离极性范围也稍小,主要用于游离脂肪酸与脂肪酸乙酯的分离。

经典溶剂体系虽为溶剂筛选指明了大致方向,但仍需结合目标产物的性质对溶剂体系进行优化,以达到最佳分离条件。其中Ito体系与Arizona体系所使用的基础溶剂相似,2种基础溶剂体系的差异主要在于筛选化合物K值的程序不同,且Arizona体系经优化后溶剂比例仅少数符合要求(Arizona体系需满足V乙酸乙酯∶V水=1∶1或V正己烷∶V甲醇=1∶1),因此,这2种溶剂体系并无明显的界限。

此外,部分学者在HBAW体系基础上进行改进,探索出更适合弱极性脂肪酸(二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等)分离的无水溶剂体系。该体系仅采用弱极性的正己烷、正庚烷与强极性的乙腈配比组成两相溶剂体系[43]。无水溶剂体系配比简单、回收便捷,常用于脂肪酸乙酯的分离。

脂肪酸在溶液中存在的弱电离平衡,使得羧基有质子化(COOH)和去质子化(COO-)2种存在形态,从而产生疏水性差异,而COO-在分离时会表现出拖尾宽峰,降低分离纯度,所以可在溶剂体系中添加适量(体积分数约为0.1%)乙酸、三氟乙酸或柠檬酸,降低溶剂体系pH值以抑制脂肪酸解离,这与Ito[40]提及的观点相吻合。

1.2 含选择性试剂的溶剂体系

鉴于HSCCC理论塔板数较低,仅采用基础两相溶剂体系对结构相似的化合物分离效果不佳,可向基础溶剂体系中添加选择性试剂,以改善体系分配平衡及化合物K值[44],从而缩短分离时间、提升分离效率。目前HSCCC分离脂肪酸常用的选择性试剂有金属离子选择性试剂和离子液体。

1.2.1 含金属离子的溶剂体系

金属离子选择性试剂是含有Ag+、Cu2+等金属离子的溶液,这类金属离子含有空的d轨道,能够接收PUFAs双键的π电子,并与之可逆地形成弱配位化合物,从而降低目标化合物K值,提升分离效率和选择性[45]。香榧子是我国独有的木本油料树种,种子中PUFAs质量分数高达79%,其中ω-6三元PUFAs—金松酸含量尤为丰富。据研究证实,金松酸有抗氧化、驱风镇咳等生理活性[46],可作为药食两用原料进一步开发。孟祥河等[47]将香榧子油乙酯化后,以无水体系(V正己烷∶V乙腈=1∶1)作为溶剂基础,分别考察添加硝酸银、三氟乙酸银、辛酸银等银盐后的分离效果。结果表明,在固定相中添加1.2 g辛酸银为最优银离子试剂,经气相色谱-质谱联用(GC-MS)离线检测,分离得到的金松酸乙酯纯度达86.78%,较未添加银盐的阴性对照组纯度提升68.95%,表明添加合适的金属离子试剂可有效提升分离纯度。此外,金属离子选择性试剂还可有效解决共洗脱问题,尤其是针对相同等效链长值(ECL)脂肪酸之间的分离。Vetter等[48]以Ito体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=3∶24∶1)作为基础溶剂体系,按体积分数1%的比例添加硝酸银至水溶液中作为银离子试剂,从芥末油脂肪酸甲酯中分离出纯度为94%的芥酸甲酯,解决了与花生酸甲酯的共同洗脱问题(芥酸和花生酸ECL均为20)。值得注意的是,由于选择性试剂中金属离子的添加,难免会对纯化产物造成污染及残留,并限制其后续在保健食品中的应用。

1.2.2 含离子液体的溶剂体系

离子液体(ILs)是一类全部由离子组成的有机盐液体,因其具有蒸汽压低、稳定性高、易脱除回收等特点,被视为传统溶剂的“绿色替代品”,已在天然产物分离中得到广泛应用[49]。ILs通过丰富的阴阳离子组合调节上、下相极性,从而优化目标化合物K值,提升溶剂体系选择性[50]。二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是鱼油中主要营养成分,在促进大脑发育、增强人体免疫中起到重要作用[51,52]。Chen等[53]以无水体系(V正庚烷∶V甲醇=1∶1)作为两相溶剂,对比ILs中不同阳离子链长及浓度的分离效果,最终选择添加质量分数为5%的1-丙基-3-甲基-胍氯盐[C3Gun]Cl作为基础溶剂体系的改性剂,将K值相近的二十碳五烯酸乙酯(EPAEE)与二十二碳六烯酸乙酯(DHAEE)峰重叠率从89%降低至47%,并成功从480 mg精制鱼油样品中提取分离出62.5 mg纯度为96.92%的EPAEE和355.4 mg纯度为95.12%的DHAEE;同时设计旋蒸浓缩及真空干燥回收方式,使ILs回收率达到87%。为阐明添加ILs后的分离机理,构建了类导体屏蔽片段活度系数模型,通过计算发现,添加ILs后改变了目标产物氢键的结合方式,使溶剂体系与EPAEE、DHAEE的极性更匹配[54],从而大幅度降低峰重叠率,有效提升分离效率[55]。

2 高速逆流色谱分离脂肪酸的洗脱模式

基于HSCCC固定相的流体特性,已开发出多种适用于脂肪酸分离纯化的洗脱模式。目前,HSCCC分离脂肪酸常见的洗脱模式有:pH区带精制模式、洗脱推挤模式以及并流洗脱模式等[14],对于结构相似或成分复杂的脂肪酸,可结合多种洗脱模式以提升纯化效率。

2.1 pH区带精制模式

pH区带精制模式是一种基于待分离产物酸性解离常数(pKa)和疏水性差异建立起来的特殊分离制备模式,通过向基础溶剂体系中加入保留酸和洗脱碱以形成稳定的pH区带,使不同化合物按pH值依次排列并被洗脱出来[56],其中常用的保留酸有三氟乙酸、乙酸、丙酸以及正丁酸等,洗脱碱有氢氧化钠、氨水等。pH区带精制模式作为分离复杂脂肪酸常用的洗脱模式,具有分离容量大、分离纯度高等特点,适用于分离在溶剂体系中稳定解离的化合物,也可根据流出液pH值变化曲线对无生色团化合物加以分离。在反相洗脱模式(常规模式)下,直链PUFAs的分离会由于ECL相近产生共同洗脱问题,导致分离效果不佳,而pH区带精制模式基于不同结构脂肪酸弱解离后pKa值的差异,可将ECL值相近的脂肪酸完全分开,破解这一难题。Englert等[32]以HBAW体系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇∶V水=4.0∶7.0∶1.4∶0.5)作为溶剂体系,比较在反相洗脱模式与pH区带精制模式下对葵花籽油的分离效果。通过蒸发光散射检测器(ELSD)及紫外-可见检测器(UV-Vis)流出色谱曲线发现,在反相洗脱模式下,ECL相同的油酸(OA)和棕榈酸峰重叠率极高,仅能对一小部分未重叠的OA进行有效分离,可分离量仅占总脂肪酸质量的5%;而采用pH区带精制模式,以三氟乙酸和氨水作为保留酸和洗脱碱,在相同条件下可从500 mg葵花籽油中分离获得纯度为98%的棕榈酸88.0 mg和纯度为95%的OA 104.3 mg,表明pH区带精制模式可有效解决ECL共洗脱问题。此外,pH区带精制模式在不降低分离度的条件下,可大幅度提升单次负载量。Han等[18-57]选用Ito体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=10∶5∶5)作为基础两相溶剂,分别向固定相和流动相中加入30 mmol/L三氟乙酸和10 mmol/L氨水作为保留酸及洗脱碱以形成稳定的pH区带,在pH区带精制模式下从18 000 mg 紫苏籽油游离脂肪酸中分离制备得到9 676.7 mg纯度为92.79%的α-亚麻酸(ALA),解决了OA、亚油酸(LA)与ALA的共洗脱问题。与此同时,pH区带精制模式与普通制备型逆流色谱相比,单次载样量提高了20倍,有望成为ALA工业化制备的有效途径。呋喃脂肪酸因具有清除自由基、缓解损伤等功效[58,59],被视为有价值、有生理活性的脂肪酸。Englert等[21]以HBAW体系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇∶V水=4.0∶7.0∶1.4∶0.5)为溶剂体系,分别向上、下相中添加35 mmol/L三氟乙酸和20 mmol/L氨水,采用pH区带精制模式从210 mg橡胶乳脂肪酸中分离出纯度为95%的9-(3-甲基-5-戊基呋喃-2-基)-壬酸[9M5] 48.4 mg,并在反相洗脱模式以Ito体系(V正庚烷∶V甲醇∶V水=4.00∶3.64∶0.36)作为两相溶剂,对分离出的9M5流分进一步纯化,使其最终纯度提升至99%,为缓解氧化胁迫诱导损伤相关研究提供药物来源。这些研究实例表明,pH区带精制模式可以有效解决相同ECL脂肪酸共洗脱问题,且其单次进样量大、回收率高,具有广阔的工业应用前景。

2.2 洗脱推挤模式

洗脱推挤模式充分利用了HSCCC两相均为液体的特性,待K值较小的化合物洗脱出来后,切换流路将固定相泵入并推挤出螺线管中K值较大的待分离组分,操作结束后螺线管内固定相已被重新替换,可直接进行下一次平衡与分离,从而实现连续性高通量分离[60]。该洗脱模式理论上可以按K值顺序将所有组分依次洗脱出来,在一定程度上弥补所使用的溶剂体系分离极性范围较窄的缺陷。Daniela等[39]以无水体系(V正庚烷∶V乙腈=5∶5)作为溶剂体系,在该模式下对裂壶藻油脂肪酸乙酯进行10次连续进样,单次进样1 000 mg,在此溶剂体系中DHAEE和二十二碳五烯酸(DPAEE)的K值均偏大(K值分别为2.15和3.83),故先采用反相洗脱模式在22.5 min内分离出DHAEE和DPAEE,再循环运行9次洗脱推挤模式,最终在第10次洗脱下获得纯度为99%的DHAEE 1 797 mg和纯度为97%的DPAEE2 164 mg,分离共耗时510 min,且在不降低分离度的情况下较仅使用反相洗脱模式节省约308 min。由此可见,洗脱推挤模式不仅拓宽了分离的K值范围,节省了筛选优化溶剂体系的时间,而且分离产物纯度高,为连续性高通量的脂肪酸分离工艺提供路径。

2.3 并流洗脱模式

并流洗脱是一种从根源缩短保留时间的洗脱模式,该模式拥有2套输液泵可分别控制流动相与固定相的泵入,使其在螺线管中以不同流速同向流动。随着固定相的不断泵入,K值大的化合物在固定相中不断向前移动,从根源上缩短了分离产物的保留时间,同时解决了K值大导致的谱带展宽问题[61]。芝麻油中各化合物含量丰富,难以摸索出最佳的溶剂体系使K=0.03的弱极性植物甾醇到K=15的强极性芝麻素均获得较高分离效率,而并流模式从根源上解决了这一难题。Simon等[16]采用HBAW体系(V正己烷∶V三氟化苯∶V乙腈=100∶35∶65) 作为溶剂体系,在并流模式下以固定相流速FS=4 mL/min、流动相流速FM=2 mL/min同时泵入螺线管,联用ELSD监测分离流分。由色谱流出曲线观察到,弱极性的甾醇首先被洗脱出来(16～38 min),其次被洗脱出来的是中等极性的游离脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸等(45～53 min),最后被洗脱出来的是强极性的芝麻素(74～79 min)。经GC-MS离线检测,分离出的LA和芝麻素均不含杂质,表明并流模式可对组成复杂、K值差异化的样品进行有效分离,在缩短分离时间的同时也解决了谱带展宽导致产物纯度的问题。

3 高速逆流色谱分离脂肪酸常用检测器

HSCCC作为一种高效的分离纯化手段,配置的各类高灵敏度检测器可满足不同类型脂肪酸的检测需求。从表2中可以看到,对于常见脂肪酸,如EPA、DHA等进行分离制备时,常选用HPLC、GC作为离线检测器对分离产物进行纯度检测;对于分离难度高、含量少的共轭体系PUFAs,如9M5进行分离时,可选用UV或DAD进行检测,以减少样品检测损耗;但对于多个未知脂肪酸的分离,则宜配置DAD作为检测器,以便对分离流分进行全谱扫描并筛选各化合物最佳波长,提升产物鉴别效率;在分离无紫外吸收或吸收较弱的脂肪酸时,可选择ELSD替代UV及DAD,其不依赖产物光学特性的优点,可快速、高效地辨识UV及DAD难以检出的产物;对结构新颖、复杂的脂肪酸,如HUFAs进行分离时,可选择MS作为离线检测器,获取产物分子质量及结构等重要信息,也可选择NMR作为离线检测器,以确定脂肪酸具体结构,为脂肪酸的定性分析提供有力帮助。

4 高速逆流色谱在分离脂肪酸中的应用

近年来,随着人们对功能性粮油食品研究的不断深入,人们逐渐意识到PUFAs在促进大脑发育、预防心血管疾病等方面发挥着重大作用[62]。因ω-6 PUFAs会产生诱炎因子,而ω-3 PUFAs产生中性或抗炎因子,故其摄取比例的失衡会致使机体免疫系统诱发慢性炎症[62],由此可见ω-3和ω-6 PUFAs在人体生长发育中起到不可或缺的作用;HUFAs是一类具有独特抗菌活性的脂肪酸,其含量会影响食品风味及营养组成[63],对食品健康有着重要意义。这些脂肪酸主要来源于动植物油脂、海洋藻类以及脂质风味食品,因此,近年来HSCCC分离脂肪酸的原料来源主要集中于油脂、藻类和脂质风味食品。

4.1 鱼油

鱼油是指从多脂鱼类中提取出的全部油脂,其富含EPA、DHA等各类PUFAs,是人体摄取ω-3 PUFAs的主要来源之一,有促进大脑发育、预防心血管疾病等生理活性[64]。郑飞洋[37]以HBAW体系(V正庚烷∶V乙醇∶V乙腈=10∶5∶5)作为溶剂体系,在反相洗脱模式下从200 mg金枪鱼油脂肪酸乙酯中分离纯化出少量纯度为85.76%的DHAEE。余琦等[34]依次采用HBAW体系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇=6∶4∶1)和Ito体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=20∶20∶3)作为溶剂,在反相洗脱模式下分2步对鱼油进行分离纯化。经HPLC分析,最终获得EPA纯度为99.62%,DHA纯度为99.60%。Lehnert等[24]以HBAW体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=700∶350∶4)作为溶剂体系,在反相洗脱模式下将0.15 mg壬二酸甲酯对照品纯度从80%提升至100%,并用作GC-MS标样对鱼头、鱼肉组织中短链脂肪酸进行定量分析。除此之外,鱼油中还含有少量ω-6 PUFAs,其与ω-3 PUFAs的摄取比例在维持机体稳态上有重要作用[62-65]。Danli等[23]以HBAW体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=350∶175∶2)作为溶剂体系对500 mg鱼油脂肪酸甲酯进行2次洗脱。GC-MS分析结果显示:从鱼油中共检测出100余种脂肪酸,并成功分离出19.8 mg 纯度为95%的ω-6 PUFAs-十六碳四烯酸甲酯。研究结果表明,反相洗脱模式虽具备从鱼油中分离高纯度活性脂肪酸(如EPA、DHA)的能力,但其单次分离量较少,难以满足对脂肪酸的需求;而pH区带精制模式在不降低分离效果的同时,可实现g级制备及后续小型规模化分离纯化的开发。Li等[22]以HBAW体系(V正庚烷∶V甲醇∶V水=100∶55∶45)作为两相溶剂,分别向固定相和流动相中添加50 mmol/L三氟乙酸及40 mmol/L氢氧化钠形成pH区带,在pH区带精制模式下分离500 mg精炼鱼油,共得到纯度为95.5%的EPA 79.6 mg和纯度为96.9%的DHA 328.3 mg;同时,增加保留酸浓度可提升固定相中产物浓度并延长保留时间,这是由于过量酸使羧酸的异质二聚体完全解离,以形成更稳定的pH区带[66]。根据这一理论提升保留酸浓度至150 mmol/L,并对1 000 mg精制鱼油进行分离制备,经GC-MS鉴定共得到纯度为95.2%的EPA 132.4 mg和纯度95.5%的DHA 617.1 mg。除此之外,还可添加ILs至溶剂体系中,以获得更好的分离效果。Chen等[53]以无水体系(V正庚烷∶V甲醇=1∶1)作为两相溶剂,添加质量分数为5%[C3Gun]Cl的ILs,从480 mg精制鱼油乙酯样品中提取分离出62.5 mg纯度为96.92%的EPAEE和355.4 mg纯度为95.12%的DHAEE,为功能性ω-3脂肪酸的高效分离提供参考。

4.2 藻油

藻类是富含ω-3 PUFAs的海洋自养生物,藻油相较鱼油而言其脂肪酸种类简单、便于提取且没有腥味,无需精炼即可进行下一步生产加工。裂壶藻作为藻类代表性品种,不仅来源广泛,而且脂肪酸中ω-3 PUFAs含量更丰富[67],是目前藻油主要来源品种之一。吴兵兵等[31]利用响应曲面法对HSCCC分离纯化DHA的进样量、流速、转速及温度等关键参数进行优化,并采用两步法分离纯化裂壶藻中的游离脂肪酸。结果发现:在温度13 ℃、流速3 ml/L、转速910 r/min的条件下,依次使用Arizona体系(V正庚烷∶V乙酸乙酯∶V甲醇∶V水=15∶1∶15∶1)和Ito体系(V正庚烷∶V甲醇∶V水=5∶6∶1)作为溶剂体系,可分别得到纯度为90.06%和 99.61%的DHA。该工作提供了一种利用响应曲面优化HSCCC分离条件的策略,并表明HSCCC可采用多步分离的方法对DHA进行高纯度提取。Daniela等[39]以无水体系(V正庚烷∶V乙腈=5∶5)作为溶剂体系,在洗脱推挤模式下连续10次进样,从10 g裂壶藻乙酯油中分离出1 797 mg 纯度99%的DHAEE和2 164 mg纯度97%的DPAEE,并对该分离工艺进行评估,有助于裂壶藻的高值化开发。此外,海藻被认为是最有望成为DHA、EPA可持续高产的生物,为此人们对常见藻类进行改性培养,力求培育出脂肪酸含量更高的新品种,以满足科研和市场需求。Simon等[25]为鉴别塔玛亚历山大藻菌株分支(Alex2, Ⅰ组),以Ito体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=350∶175∶2)作为溶剂体系对混合藻油脂肪酸甲酯进行分离,经GC-MS检验,共分离纯化出22种脂肪酸,其中OA、十八碳四烯酸、十八碳五烯酸等PUFAs占总脂肪酸质量的80%,表明HSCCC对于成分复杂的样品具有良好的分离效果,为后续建立脂肪酸定性专用质谱库、鉴别菌株分支奠定基础。

4.3 植物油

植物油是指从果实、种子中得到的全部油脂,其PUFAs含量尤为丰富,是潜在的功能性油源。葵花籽油作为我国常用的煎炸油类,虽然较高比例的饱和脂肪酸(质量分数约为12%)可使其更耐煎炸[68],但长期食用这类脂肪酸会降低血液中高密度脂蛋白,不利于身体健康[69];而PUFAs(如OA、LA等)在具有良好抗氧化性的同时还有促进机体代谢等生理功能。因此,可选用大宗食用油作为基础油,添加适当比例高纯度PUFAs,调配获得具有降脂等保健功能的调和油,以满足大众膳食脂肪酸营养需求。Englert等[32]利用pH区带精制模式对500 mg葵花籽油进行分离纯化,以HBAW体系(V正己烷∶V乙腈∶V甲醇∶V水=4.0∶7.0∶1.4∶0.5)作为溶剂体系,选用三氟乙酸和氨水作为保留酸和洗脱碱,据ELSD和UV流出曲线显示,分离获得纯度95%的OA 104.4 mg和纯度95%的LA 194.2 mg。同理,Han等[18]在pH区带精制模式下对600 mg紫苏籽油进行分离纯化,选用Ito体系(V正己烷∶V甲醇∶V水=10∶5∶5)作为基础两相溶剂,三氟乙酸和氨水作为保留酸及洗脱碱,分离获得纯度分别为95.36%、89.55%、81.20%的ALA、LA和OA;Cao等[33]采用HBAW体系(V正庚烷∶V乙腈∶V乙酸∶V甲醇=4∶5∶1∶1)作为溶剂体系,对1 000 mg超临界流体萃取的葡萄籽油进行分离纯化,获得纯度为99%的LA 430 mg。利用HSCCC的反相洗脱模式或pH区带精制模式,可实现对植物油中功能性脂肪酸的分离纯化,为后续进一步开发营养均衡的功能性调和油提供原料。植物油中除含有PUFAs外,还含有活性功能独特的HUFAs,其良好的抗真菌活性较传统杀菌剂更安全、高效,这与其结构有着紧密联系[27-70]。为进一步揭示HUFAs抗菌机理,亟需采用高效、温和的手段进行分离后进一步探究。Liang等[17]从马桑种子中回流萃取出马桑籽油,经碱水解皂化后得到202.6 mg游离脂肪酸,在Arizona体系(V正己烷∶V乙酸乙酯∶V甲醇∶V水=3.5∶1.5∶3.5∶2.0)作为溶剂体系的条件下,分离出13-羟基-9,11-十八碳二烯酸,并以LA、OA作为对照,对17种食物常见腐败真菌进行活性抑制测试,结果表明13-羟基-9,11-十八碳二烯酸的抗菌活性具有明显的特异性:其对真菌孢子及菌丝有较强抑制活性,最低抑制浓度MICs<(0.67±0.29)g/L,且远高于LA、OA,MICs<(3.33±0.15)g/L;但对多数酵母菌无明显抑制效果(MICs>8.00 g/L),有望成为天然抗真菌添加剂加以开发利用。

鱼油中脂肪酸极性范围较窄,常选用HBAW体系对鱼油中的脂肪酸进行分离纯化;而藻油和植物油中脂肪酸极性范围较广,需采用Ito体系或Arizona体系。鱼油和藻油中脂肪酸含量丰富且种类简单,可选用反相洗脱模式;而植物油中脂肪酸种类复杂,需采用pH区带精制模式或联用其他分离纯化手段才可进行高纯度脂肪酸的分离。此外,对于分离需求量较少的脂肪酸,可选用反相洗脱模式,而在规模化制备时,应选择pH区带精制模式或洗脱推挤模式进行高通量制备;亦或在反相洗脱模式的溶剂体系中添加ILs,以缓解高通量分离时拖尾峰所导致的分离度降低。建议谨慎使用金属离子选择性试剂,并对分离全过程中的金属离子浓度进行监控,避免产物因重金属含量过高而无法加以利用。

4.4 脂质风味食品

脂质风味食品是指将富含动植物油脂的物质经过油炸、发酵等工艺处理后得到的食物,其脂肪酸组成较鱼油、藻油而言更丰富。其中HUFAs对食品风味、保质期以及营养有较大影响[71],例如香肠中微生物的发酵会影响其脂肪酸组成[72],进而造成特征风味及营养成分的改变。因此,对发酵过程中产生的脂肪酸进行分离,有利于阐明发酵机理、优化发酵工艺、改善特征风味。Liang等[73]为探究香肠中脂肪酸代谢与发酵菌种、时间的关系,分别在灭菌香肠上接种了沙克乳酸杆菌(Lactobacillussakei)、肉葡萄球菌+沙克乳酸杆菌(Staphylococcuscarnosus+Lactobacillussakei),并与阴性组进行对照。以Arizona体系(V正己烷∶V乙酸乙酯∶V甲醇∶V0.1%乙酸=4∶1∶4∶1)作为溶剂体系对发酵0、3、20 d的香肠脂肪酸进行分离鉴定。经GC-MS检验表明,香肠中游离脂肪酸的总代谢速率并未因Lactobacillussakei与Staphylococcuscarnosus菌株的添加而改变,表明游离脂肪酸是由内源性脂肪酶所产生;但菌株的添加会导致LA、ALA逐渐转化为HUFAs,并对其风味产生影响,这有助于通过定量分析脂肪酸组成判断发酵阶段及发酵质量,进一步改善发酵工艺。

5 总结与展望

对HSCCC分离脂肪酸的溶剂体系、分离模式、检测器及实际应用进行了综述。根据目标脂肪酸的性质可大致筛选溶剂体系(极性或非极性),对于难分离的化合物(结构相似,ECL相同)可通过添加选择性试剂(金属离子或ILs等)以改善其分离效果;在模式选择方面,HSCCC提供了多种洗脱模式(pH区带精制模式、洗脱推挤模式、并流模式等)可实现脂肪酸的高效快速分离;同时HSCCC配备的多种检测器(包括UV-Vis、ELSD、MS、NMR等)可对分离产物的结构进行鉴定,提高分离的准确性。

HSCCC作为分离纯化脂肪酸的重要手段之一,目前仍存在一些不足。HSCCC的理论塔板数较低,需要选用合适的溶剂体系或洗脱模式进行弥补;HSCCC仅能进行定向分离,而对结构新颖、活性强的脂肪酸暂无前端活性筛选方法进行支持,需考虑与虚拟筛选结合提高分离的针对性;MS和NMR作为解析脂肪酸具体结构的有力工具,暂未实现与HSCCC的在线联用,常需要与其他专属型检测器(如ELSD)等联用;HSCCC仍未实现活性脂肪酸的在线筛选,使其分离往往具有一定的盲目性,需在检测器端增加对应活性快速筛选系统。由此可见,HSCCC在脂肪酸分离纯化领域尚有许多探索的空间。