分析保护剂对大米中农药残留检测(GC-MS/MS)基质效应补偿作用的评价及应用研究

喻 玲, 张 蕊, 朱 琳, 张 冰, 张 妤, 郭宝元, 王松雪

(上海理工大学健康科学与工程学院1,上海 200093)

(国家粮食和物资储备局科学研究院2,北京 100037)

农产品种植或储藏时使用农药后难以避免产生农药残留。大米中农药残留限量指标检测是监测和评价大米质量安全的重要手段之一,其检测技术一直备受人们的关注[1-6]。其中气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)技术具有快速、准确、灵敏度高、重现性好的特点,是农药残留分析中应用最普遍的技术[7-9]。而基质效应(MEs)一直是影响GC-MS/MS检测的重要因素[10]。GC-MS/MS基质效应主要发生在进样口到色谱柱以及色谱柱到检测器之间,通常认为是待分析农药与硅醇基及其与玻璃衬管表面金属离子间的相互作用所致。当基质成分通过衬管和色谱柱时掩蔽活性位点,减少了分析物的吸附和分解,与无基质注射相比有更多的分析物到达检测器,导致基质诱导增强效应[11]。

GC-MS/MS农药残留检测中通常采用基质匹配法[12]、同位素标记内标法[13]、标准加入法[14]、分析保护剂法[15]等方法消除基质效应带来的影响。其中分析保护剂(AP)可以与农药竞争吸附衬管中的活性位点,减少了在这些活性位点上吸附或降解引起的敏感分析物的损失,尤其是热不稳定农药,从而提高纯溶剂中农药的响应值,使之接近基质中农药的响应[16]。目前在农残分析中应用的分析保护剂主要有3-乙氧基-1,2-丙二醇[17-20]、L-古洛糖酸-γ-内酯[21]、山梨糖醇[22]、D-核糖酸-γ-内酯[23-24]、莽草酸[25]、聚乙二醇[26-27]、乙二醇[28]、橄榄油[29]、深共晶溶剂[30]等。莽草酸是碱不稳定农药的保护剂,3-乙氧基-1,2-丙二醇是挥发性农药的合适分析保护剂,对出峰较早的农药有明显的保护作用,L-古洛糖酸-γ-内酯是半挥发性农药的合适保护剂,山梨糖醇可以作为低挥发性农药的合适保护剂,对晚洗脱农药有较好的补偿效果[31],但山梨糖醇对保留时间位于中部的农药补偿效果好[32],复合分析保护剂往往可实现对性质差异较大农药的满意定量[31,32]。大米中农药残留限量众多,性质差异大,多残留同时检测性能保障难度大,利用分析保护剂是提高大米中多农残检测性能的途径之一。目前有关保护剂在气质联用大米多农残检测中基质效应补偿作用的系统研究鲜有报道。

研究以大米中47种农药及其代谢物(GB 2763—2021)为研究对象,系统考察了D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇4种分析保护剂对基质效应的补偿作用,进一步优化复合分析保护剂,探讨复合分析保护剂对大米农药残留检测定量分析结果可靠性的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TRACE1310-TSQ8000Evo气相色谱/三重四级杆质谱联用仪,配有EI源;5810R离心机,TARGINVX-Ⅲ多管涡旋振荡器。

乙腈(色谱纯)、乙酸(色谱纯)、无水硫酸镁(分析纯)、氯化钠(分析纯)、PSA和三官能十八烷基/硅胶基体(C18,粒径40 μm)、实验用水为Mili-Q超纯水、L-古洛糖酸-γ-内酯(分析纯)、D-山梨糖醇(分析纯)、莽草酸(分析纯)、3-乙氧基-1,2-丙二醇(分析纯)。

农药标准品:47种农药及其代谢物单标,质量浓度为1 000 μg/mL。

原料:大米。

1.2 溶液配制

农药标准工作溶液:用乙腈配制47种农药及其代谢物混合标准储备液,于-20 ℃保存。使用前用乙腈或空白基质溶液稀释至所需质量浓度。

D-山梨糖醇储备液(50 mg/mL):称取山梨糖醇500 mg于10 mL容量瓶中,加5 mL水溶解后,乙腈定容。

L-古洛糖酸-γ-内酯储备液(50 mg/mL):称取L-古洛糖酸-γ-内酯500 mg于10 mL容量瓶中,加4 mL水溶解后,乙腈定容。

莽草酸储备液(50 mg/mL):称取莽草酸500 mg于10 mL容量瓶中,加4 mL水溶解后,乙腈定容。

3-乙氧基-1,2-丙二醇储备液(150 mg/mL):称取3-乙氧基-1,2-丙二醇150 mg于1 mL容量瓶中,用乙腈定容。将4种储备液按不同配比进行混合,用于AP优化。

1.3 样品前处理

样品提取:称取5 g粉碎的均匀试样(精确到0.001 g)于50 mL 离心管中,加入 20 mL 70∶29∶1(体积比)的乙腈∶水∶乙酸混合溶液,2 500 r/min 涡旋混匀20 min,7 000 r/min离心5 min,取上清液10 mL,加入 2.0 g 无水硫酸镁和 0.8 g 氯化钠,以2 700r/min涡旋混匀5 min,使乙腈和水相分层。

样品净化:移取2 mL上层乙腈溶液于15 mL刻度离心管中,离心管中事先加入20 mg PSA、50 mg C18、300 mg无水硫酸镁,摇匀后2 500 r/min涡旋混匀5 min,7 000 r/min离心 5 min,取上清液过 0.2 μm滤膜。

样品上机液配制:准确移取1 mL过滤后的溶液于进样瓶,并加入分析保护剂溶液0.06 mL,摇匀,待测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱:TraceGOLDTMTG-OCPI色谱柱;30 m×0.25 mm×0.25 μm;色谱柱温度:50 ℃,保持1 min,以25 ℃/min升温至100 ℃,以8 ℃/min升温至300 ℃,保持10 min;载气:氦气,纯度≥99.999%,流速1.0 mL/min;进样口温度:280 ℃;进样量:1 μL;进样方式:不分流进样。

1.4.2 质谱条件

电子轰击源:70 eV;离子源温度:300 ℃;传输线温度:280 ℃。

多反应监测:每种农药分别选择1对定量离子、1对定性离子。每种农药的保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压,见表1。

表1 47种农药及代谢物的质谱条件

2 结果与分析

2.1 大米中47种农药及其代谢物基质效应的评价

配制质量浓度为100 μg/L的农药纯溶剂(乙腈)标液及大米基质标液,采用基质中目标物响应值(峰面积)与纯溶剂中目标物响应值(峰面积)比值(用百分数表示),对大米中农药基质效应进行评价。除特乐酚和戊硝酚外,大米中其他45种农药及代谢物基质效应>120%,为基质诱导增强效应。

2.2 单一分析保护剂对MEs的影响

本研究选用D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-内酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇4种分析保护剂,考察每种保护剂不同浓度下对溶剂中农药基质效应的补偿作用及对峰形的改善效果。配制质量浓度为100 μg/L农药混合标准乙腈溶液,分别添加单一不同浓度的保护剂,使上机液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸的质量浓度均依次为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL,3-乙氧基-1,2-丙二醇的质量浓度依次为0.25、0.50、1.00、2.00、6.00 mg/mL。采用加入AP溶剂中目标物响应值与纯溶剂中目标物响应值比值(用百分数表示),评价分析保护剂对溶剂中农药基质效应补偿作用。

从图1中看出,当上机液中D-山梨糖醇为0.1、0.2、0.4 mg/mL低质量浓度时,D-山梨糖醇对溶剂中绝大部分农药无基质补偿作用,出现不显著的基质抑制效应,初步分析可能当D-山梨糖醇浓度较低,抢占活性位点优势不明显,反而因D-山梨糖醇添加又产生了新的活性位点吸附农药,从而表现出基质抑制效应。当添加质量浓度增加到0.8 mg/mL时,基质效应由抑制转为增强,除α-六六六、氯丹、特乐酚、狄氏剂、p,p′-滴滴滴、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴涕外,其他农药均表现出明显的基质补偿作用,特别是对出峰时间17.8 min之前的农药(除特乐酚、戊硝酚外)基质补偿作用显著,与基质溶液中农药响应相当,但17.8 min后大部分农药的响应仍与基质溶液中有较大差距。当添加质量浓度为1 mg/mL时,除特乐酚、戊硝酚外,其他农药并未出现进一步的基质补偿。说明添加质量浓度为0.8 mg/mL时,气相色谱中的活性位点几乎已经被全部占据,继续增加D-山梨糖醇,不能表现更好的补偿作用。确定D-山梨糖醇单一添加时,最佳质量浓度为0.8mg/mL。随着D-山梨糖醇浓度的增加,溶剂中农药的峰形有明显的改善,但敌稗和甲萘威仍存在拖尾的现象,见图2。

图1 不同浓度的D-山梨糖醇对溶剂中农药基质效应的影响

图2 D-山梨糖醇对溶剂中敌稗和甲萘威的峰形改善效果

与D-山梨糖醇不同,当上机液中L-古洛糖酸-γ-内酯和莽草酸为0.1、0.2、0.4 mg/mL低质量浓度时,绝大部分农药无基质抑制效应。在0.1～0.8 mg/mL范围内,溶剂中农药响应随莽草酸添加质量浓度增加呈现明显递增趋势,而添加L-古洛糖酸-γ-内酯的溶液中仅氯酞酸甲酯之前出峰的农药响应随添加质量浓度增加缓慢递增。当L-古洛糖酸-γ-内酯和莽草酸添加质量浓度分别继续增加到1 mg/mL时,与D-山梨糖醇类似,溶剂中农药并未出现明显进一步的基质补偿。确定L-古洛糖酸-γ-内酯和莽草酸单一最佳添加质量浓度为0.8 mg/mL。

由图3可见,添加不同质量浓度3-乙氧基-1,2-丙二醇时,14.5 min之前出峰的农药,随着添加浓度增大,基质效应由抑制逐渐变为增强,达到基质溶液中农药响应水平;14.5 min之后出峰的农药,基质抑制效应明显,且农药响应不随添加浓度增加而发生明显变化。3-乙氧基-1,2-丙二醇对在溶剂中峰形较差的农药没有明显改善,如敌稗、甲萘威、氟除草醚、格螨酯、三唑磷和氟酰胺,甚至氟除草醚和格螨酯拖尾更加严重;但添加2.0、6.0 mg/mL时,氯苯甲醚和禾草敌前延峰得到非常明显的改善。而D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯或莽草酸对氯苯甲醚和禾草敌前延峰没有改善,这是因为3-乙氧基-1,2-丙二醇是挥发性农药的合适分析保护剂,对出峰较早的农药有明显的保护作用[30]。确定3-乙氧基-1,2-丙二醇单一添加时,最佳质量浓度为2.0 mg/mL。

图3 3-乙氧基-1,2-丙二醇对溶剂中氯苯甲醚和禾草敌的峰形改善效果

在理想状态下通常认为在纯溶剂标样和待测样品中加入相同量的分析保护剂,保护剂能同等程度地补偿标样溶液和样品溶液的基质效应。为此,研究同时考察了每种分析保护剂不同浓度下对大米基质中农药的基质效应,并与添加同样分析保护剂的乙腈溶液中农药的基质效应进行对比。实验中配制质量浓度为100 μg/L农药混合大米基质溶液,分别添加不同浓度单一分析保护剂。在D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸最佳质量浓度下(0.8mg/mL)下,分别对应有14、13、21种农药及其代谢物的基质补偿为80%～130%,可见单一保护剂对全部47种农药及其代谢物的补偿效果不太理想。

2.3 复合分析保护剂的优化

单一分析保护剂对大米中农药MEs补偿作用研究表明,单一分析保护剂作用存在局限性。D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇对低挥发性农药、半挥发性农药和挥发性农药的基质效应补偿作用各不同。如进行复配,发挥各自优势,可能实现对性质差异较大农药的基质效应补偿作用。本研究在单因素实验的基础上,设计L9(34)正交实验,进一步优化复合分析保护剂,见表2。

表2 优化复合分析保护剂正交实验

当分别向基质混标和溶剂混标溶液中添加不同质量浓度组合的D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇混合溶液时,不同浓度组合所对应的基质效应有显著差异,见表3。从基质补偿作用看,混合AP最优组合为AP5,有29种农药及其代谢物的ME比值为80%～130%,可见无论是单一保护剂还是复合保护剂很难确保对标样溶液中所有农药的响应增强作用都达到农药在样品溶液中的响应程度,即对基质效应无法达到同等程度补偿的目的,难以实现无空白基质的基质中农药的准确定量,这一结论与文献一致[2]。组合AP5中,禾草敌和氯苯甲醚的前延峰明显,而组合AP3,即样品上机液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇质量浓度为0.2、0.8、0.8、2.0 mg/mL时对这2种农药前延峰改善效果良好且其他分析物峰形也处于较理想状态,补偿综合作用良好(见图4),因此,在实际测定过程,采取AP3保护剂基质标曲作为样品定量标曲。

图4 AP3和AP5对氯苯甲醚和禾草敌峰形的影响

表3 复合分析保护剂对大米基质中农药与对溶剂中农药基质效应补偿作用对比

2.4 方法的回收率、精密度和检出限

选用本研究优化的复合分析保护剂AP3基质标曲定量,各农药标准曲线在2.5～200.0 μg/L范围内,线性良好,相关系数(R2)均大于0.996。以空白大米样品作为添加回收实验的基质,加标水平分别为10、100、200 μg/kg,每个加标水平进行3次平行实验,计算各添加水平下的回收率及相对标准偏差(见图5)。在10 μg/kg添加水平下,各农药回收率62.2%～117.7%,相对标准偏差0.3%～29.3%;在100 μg/kg添加水平下,各农药回收率79.3%～97.1%,相对标准偏差0.4%～10.8%;在200 μg/kg添加水平,各农药回收率 83.1%～96.4%,相对标准偏差0.4%～14.9%。除灭草环在10 μg/kg回收率(58.7%)略低于农业部公告2386号要求(0.01 mg/kg添加水平,60%～120%),三氟硝草醚在10 μg/kg回收率(122.2%)略高于农业部公告2386号要求(0.01 mg/kg添加水平,60%～120%)外,其他农药在10～200 μg/kg添加水平下,均符合公告要求。该方法各农药定量限为0.01 mg/kg,检出限小于0.001 mg/kg,能满足GB 2763—2021 中大米中农药限量检测的要求,可应用于大米中限量农残的日常检测工作中。该法与GB 23200.113—2018对比,在3个加标水平下,47种农药及代谢物回收率结果更好,特别是低沸点易挥发农药优势明显。

图5 2种方法47种农药及代谢物不同水平加标回收率对比

3 结论

通过系统研究4种分析保护剂对大米中47种农药及其代谢物基质补偿作用的影响,确定了单一保护剂的最佳添加浓度,为科研工作者开展分析保护剂在大米农残检测中的应用研究提供了参考思路。经优化,获得的复合分析保护剂AP3(上机液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-内酯、莽草酸、3-乙氧基-1,2-丙二醇的质量浓度分别为0.2、0.8、0.8、2.0mg/mL),能有效改善禾草敌和氯苯甲醚的前延峰,且其他分析物峰形也处于较理想状态,补偿综合作用良好。

本研究建立的同时检测大米中47种农药及其代谢物残留的方法,采用AP3基质标曲定量,操作简单,定量准确,各农药标准曲线在2.5～200.0 μg/L范围内,线性良好,相关系数(R2)均大于0.996,定量限为0.01 mg/kg,样品平均加标回收率满足方法学要求,与GB 23200.113—2018对比,47种农药及代谢物回收率结果更好,适用于大批量大米样品中农药筛查和定量检测。