利拉鲁肽激活Wnt/β-catenin信号通路保护大鼠急性脊髓损伤后神经功能的分子机制研究

崔拥国, 杨成亮, 李晓强, 李奕廷, 黄 昊, 刘 佳

(1广西壮族自治区右江民族医学院/2右江民族医学院附属医院, 广西 百色 533000)

脊髓损伤对患者的生命健康和生活质量造成了严重危害,加重了患者家庭及社会的负担[1]。既往数据表明,每10亿人中每年有约2万例新发脊髓损伤患者,并有逐渐老龄化的趋势[2]。脊髓受损可分为原发性和继发性两种情况。前者是指直接或间接作用于脊髓的外部力量所造成的损伤,而后者则是指外部力量导致脊髓水肿、椎管内微血管破裂形成血肿、骨折造成脊髓受压以及椎间盘组织破裂等进一步损害脊髓的情形。脊髓损伤患者可能面临损伤介导的各种多系统并发症,包括细胞凋亡和炎症[3]。Wnt/β-catenin信号通路参与细胞增殖、神经形成及凋亡等多种生物学过程[2]。β-catenin蛋白是一种进化保守的多功能蛋白,是Wnt/β-catenin信号通路的关键核心成员,可通过与核转录因子结合发挥对下游靶基因表达的调控作用[4]。有文献[5]报道Wnt/β-catenin通路的激活在脊髓损伤中具有抗凋亡和抗炎作用。利拉鲁肽是目前国际上广泛应用于2型糖尿病的降糖药。近年来的研究表明,利拉鲁肽可以引发自噬,防止氧化,减少神经炎症的发生[6]。有研究表明利拉鲁肽可通过激活Wnt/β-catenin信号通路在多种疾病的治疗中发挥作用[7-8]。然而,利拉鲁肽治疗脊髓损伤的分子机制尚未明确。因此,本研究探讨利拉鲁肽通过Wnt/β-catenin通路对急性脊髓损伤大鼠运动功能、神经细胞凋亡及炎症因子水平的影响,为利拉鲁肽治疗脊髓损伤的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 由广东维通利华实验动物技术有限公司提供60只SPF清洁级健康雄性SD大鼠[许可证号:SCXK(粤)2022-0063)],鼠龄7～8周,体重280～320 g。本研究所有流程通过了右江民族医学院动物伦理学委员会的审核(审查号:YYFY-LL-2024-217),实验过程严格按照动物伦理学有关规定进行。

1.1.2 主要仪器、药物及试剂 多功能酶标仪(美国珀金埃尔默股份有限公司);高速冷冻离心机(HC-2518R)(安徽中科中佳科学仪器有限公司);聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)仪(美国伯乐生命医学产品有限公司);XAV939(纯度99.49%,AbMole中国分公司);酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)试剂盒(美国Tsz Biosciences公司);二氢乙锭(hyfrothidine,HEt)(美国Medchemex-press公司);β-连环蛋白(β-catenin)、白介素6(IL-6)、胱天蛋白酶3(caspase-3)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和β-肌动蛋白抗体(β-actin抗体)均由abcam公司提供;山羊抗兔WB二抗(武汉博士德公司)。

1.2 急性脊髓损伤大鼠模型建立及分组60只SD大鼠随机选取15只作为假手术组(仅接受T9～T10椎板切除术),其余45只大鼠采用改进Allens技术建立急性脊髓损伤模型。腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)进行麻醉,消毒和切开大鼠背部,暴露棘突,去除T9～T10椎板后清晰暴露脊髓。然后,从3 cm的高度落下一个打击器(重量10 g,直径2 mm)打击T10节段脊髓。造模成功判定标准为:击打处脊髓出现淤血,大鼠全身抖动,双下肢迅速退缩和颤抖,并有大小便失禁等。脊髓损伤模型建立成功后,随机分为模型组、利拉鲁肽组和利拉鲁肽+XAV939组,各15只。术后各组切口每天碘伏消毒2次,青霉素4 wu/次、2次/d,共3 d,避免感染。膀胱每天按摩3次,共3天以促进自然排尿功能的恢复。在脊髓损伤后的14 d内每组干预措施如下:假手术组和模型组大鼠每天皮下注射50 mg/kg生理盐水,利拉鲁肽组大鼠每天皮下注射50 μg/kg利拉鲁肽, 利拉鲁肽+XAV939组大鼠每天皮下注射50 μg/kg利拉鲁肽和0.4 mg/kg XAV939(一种Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂)。

1.3 检测指标

1.3.1 运动功能评分 采用BBB评分(Basso, Beattie &Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)对脊髓损伤大鼠干预后下肢功能恢复情况进行评估。方法如下:将大鼠置于一个宽敞的开口容器内,用近距离的方式观察大鼠在爬行时后肢各关节的活动能力与协调性。评分范围为0～21分,分别于术前、干预后第7天、第14天对大鼠下肢运动功能进行评估,分值较高的大鼠下肢功能恢复较好。实验采用双盲、两人独立打分法。每只大鼠重复测定3次,取平均值并记录。

1.3.2 Western blot分析 术后干预的第14天,腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠,并切开T8-11脊髓。用放射免疫沉淀法裂解缓冲液中的均质组织。然后,使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,调整至2 μg/μL,并用12%分离胶分离蛋白质。随后,蛋白质被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜置于5%脱脂奶粉中,室温密封1 h,与一抗β-catenin、IL-6、caspase-3、TNF-α和β-actin(均为1∶1 000),在4℃慢摇床环境下孵育过夜,第2天1×TBST清洗PVDF膜3次,每次5 min,后放入二抗稀释液稀释的二抗(1∶5 000,武汉博士德公司)室温慢摇床60 min,再用1×TBST清洗3次,每次5 min,用UVP凝胶电泳仪对其进行图像处理。利用ImageJ2X软件对蛋白质条的灰度值进行计算,并与β-actin的灰度值进行比较和分析。

1.3.3 苏木精-伊红染色及尼氏染色 (1)苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色步骤:冰冻切片取自脊髓损伤中央3 mm处接近尾部的组织,厚8 μm。-80℃冰箱中移出切片,4℃的冷藏室中放置30 min,室温下复温20 min;切片置于染盒中,0.01 mol/L PBS溶液洗片3次,每次5 min,可见包埋剂溶解;苏木精染色5 min,水洗。切片在1%盐酸乙醇中浸泡5 s,用水冲洗;氨水回蓝溶液洗涤5 s,用水冲洗干净;伊红染色30 s后用水冲洗。80%乙醇-95%乙醇-无水乙醇-无水乙醇梯度褪色10 s。二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)各浸泡5 min。中性胶密封切片,安装切片,在光学显微镜下观察。(2)尼氏染色步骤:将切片从-80℃的冰箱中移置4℃冰箱中冷藏30 min,室温下复温20 min;将切片置于染盒中,0.01 mol/L PBS液洗3次,每次5 min,可见到包埋剂溶解。将清洗好的切片浸于尼氏染料中,将染盒置于37℃恒温箱中,8 min后再用去离子水清洗2次,每次10 s,采用95%乙醇洗30 s;二甲苯5 min,重复1次;切片干燥,中性树脂封片,用无色指甲油密封盖住盖玻片的上端和下端,采用光学显微镜对其进行观测。

2 结果

2.1 各组大鼠BBB评分的比较4组大鼠术前BBB评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);干预后第7天、第14天时,模型组、利拉鲁肽组及利拉鲁肽+XAV939组的BBB评分相较于术前显著降低,并显著低于假手术组(P<0.05),利拉鲁肽组的BBB评分显著高于模型组和利拉鲁肽+XAV939组(P<0.05),而模型组与利拉鲁肽+XAV939组的BBB评分比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组大鼠肢体运动功能的比较 分)

2.2 各组大鼠脊髓组织病理形态的比较模型组、利拉鲁肽组及利拉鲁肽+XAV939组大鼠脊髓前角尼氏染色阳性细胞数量明显少于假手术组(P<0.05);与模型组和利拉鲁肽+ XAV939组相比,利拉鲁肽组的脊髓组织损伤较轻,组织形态较好,尼氏染色阳性细胞的数量显著增加(P<0.05);而模型组与利拉鲁肽+ XAV939组尼氏染色阳性细胞数量相比差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

注：A,HE染色、尼氏染色检测各组大鼠脊髓组织病理形态及神经元死亡情况;B,脊髓前角运动神经元定量分析; ***P<0.001。

2.3 各组大鼠脊髓组织β-catenin、caspase-3、TNF-α和IL-6表达水平的比较相较于假手术组,模型组β-catenin、caspase-3、IL-6和TNF-α表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,利拉鲁肽组β-catenin表达显著升高,caspase-3、IL-6和TNF-α的表达显著降低(P<0.05);与利拉鲁肽组相比,利拉鲁肽+XAV939组β-catenin表达显著降低,caspase-3、IL-6和TNF-α的表达明显升高(P<0.05),而模型组与利拉鲁肽+XAV939组β-catenin、caspase-3、IL-6和TNF-α表达水平相比,差异无统计学意义(P>0.05),见图2、3。

注： A, Western blot实验结果; B, β-catenin蛋白表达水平; C, caspase-3蛋白表达水平; D, TNF-α蛋白表达水平; E, IL-6蛋白表达水平。 **P<0.01, ***P<0.001。

图3 各组大鼠脊髓组织β-catenin、caspase-3、TNF-α、IL-6蛋白免疫组化染色结果

3 讨论

脊髓损伤是一种具有高致残、致畸及高死亡率特征的中枢神经系统创伤性疾病,治疗难度大,严重危害患者的身心健康。急性脊髓损伤发生后,机体会出现神经细胞凋亡、炎症水平上升等一系列过程,从而加重病情[9]。研究表明[10],利拉鲁肽在包括脊髓损伤等神经系统疾病的治疗中具有一定价值,但相关机制还未完全明确。本研究发现利拉鲁肽可通过激活Wnt/β-catenin信号通路,减少神经细胞凋亡,降低炎症因子水平,从而发挥对急性脊髓损伤大鼠的神经保护作用。

Wnt/β-catenin信号途径在胚胎发育、肿瘤发生、细胞凋亡等方面起着关键的调控作用,研究表明该通路在急性脊髓损伤发生后发挥着关键作用[11]。贾云峰等[12]的研究显示,甲基强的松龙可通过激活Wnt/β-catenin信号通路对大鼠急性脊髓损伤模型发挥神经保护作用。Gao等[13]的研究发现,Wnt-3a可通过激活Wnt/β-catenin信号通路对大鼠脊髓损伤后发挥神经保护作用。另一项研究也表明,HSP70可通过激活Wnt/β-catenin信号通路缓解大鼠脊髓损伤[14]。XAV939是一种高效的、能够穿透细胞的小分子抑制剂,它能够特异性地抑制多聚ADP核糖基化酶TNKS1和TNKS2。通过稳定axin蛋白的活性,XAV939促进了β-catenin的降解,从而破坏了Wnt信号通路[15]。在本研究中,我们的实验也证实了在脊髓损伤大鼠中,利拉鲁肽可激活Wnt/β-catenin信号通路,XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路。

在本实验中,SD大鼠在脊髓损伤后给予利拉鲁肽干预,结果表明,利拉鲁肽治疗能增加脊髓损伤大鼠的运动功能评分和脊髓前角运动神经元的数量,从而促进脊髓损伤后大鼠运动神经功能的恢复。而相较于利拉鲁肽组,利拉鲁肽+XAV939组大鼠的运动功能恢复情况显著降低,并且与模型组大鼠类似。此外,脊髓损伤大鼠应用利拉鲁肽干预可显著降低凋亡相关蛋白caspase-3和炎性因子TNF-α、IL-6的表达水平。而相较于利拉鲁肽组,利拉鲁肽+XAV939组大鼠的caspase-3、TNF-α、IL-6显著升高,并且与模型组大鼠类似。Zhao等[16]的研究发现,在大鼠脊髓半切模型中应用一种复合水凝胶支架后,通过激活Wnt/β-catenin信号传导系统,可实现神经干细胞向神经元分化并促进神经细胞生长,使受损的脊髓组织得到修复。caspase-3是细胞凋亡过程中的一个关键酶,有研究显示[17],在海马脊髓损伤后caspase-3表达水平显著上升,表明脊髓损伤可能诱导海马的神经元凋亡。脊髓损伤会引起炎症反应的激活,TNF-α、IL-1β、IL-18和 IL-6的升高会加重神经元炎症和脊髓损伤[18]。本研究结果提示,急性脊髓损伤可引起细胞凋亡和炎症反应的激活,而利拉鲁肽可激活Wnt/β-catenin信号通路,使β-catenin上升,降低caspase-3、TNF-α和IL-6表达水平,发挥抑制细胞凋亡,减轻炎症反应的作用,从而有助于脊髓损伤后的功能恢复。

综上所述,利拉鲁肽可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路调控相关蛋白的表达水平,减轻神经细胞凋亡及炎症反应,从而对急性脊髓损伤大鼠发挥神经保护作用。