新疆桑白皮提取物对主要致龋细菌生物膜作用的实验研究

吴 龙, 阿尔曼·阿卜力孜, 玛依奴尔·阿塔吾拉, 赵 今

(1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)牙体牙髓病科; 2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所, 乌鲁木齐 830054)

龋病是牙体硬组织常见的慢性感染性疾病之一,龋病及其并发症可诱发全身疾病或使全身疾病加重,降低了患者生活质量,增加了经济负担[1]。龋病的发生和发展是由细菌、宿主等多种因素共同作用引起的,如菌斑生物膜的组成和生化性能、饮食习惯、遗传因素和牙体结构等[2]。龋病防治的关键措施在于预防,其中防止牙菌斑形成对于避免龋病的发生尤为重要。天然药物因副作用小、经济、安全等优点已成为龋病防治研究的重点。相关研究证实多种天然药物对致龋细菌及生物膜生长有良好的抑制作用,从而达到防龋作用[3-6]。桑白皮(MoriCortex)为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮,其中包含黄酮类、呋喃类、香豆素类等[7-8],具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性[9-13]。新疆桑白皮主要产自于新疆南部地区,含有多种的活性成分,具有独特的自然22倍体染色体倍数性[14]。本课题组前期研究发现新疆桑白皮提取物对变异链球菌、血链球菌和黏性放线菌浮游状态下生长及致龋相关毒力因子有良好的抑制作用,并证明对生物膜形成也有一定的抑制作用[15]。本研究探究新疆桑白皮提取物对主要致龋细菌在生物膜状态下产酸、产糖等致龋毒力因子及生物膜活性的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药SW-CJ-2D超净工作台(上海博讯实业有限公司);3-18KS台式高速冷冻离心机(Sigma公司);Multiskan GO酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);DHP-9082电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);Gold S54紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司);PHS-3CpH计(上海雷磁是仪电科学仪器股份有限公司);新疆桑白皮药材:由新疆医科大学天然药物重点实验室提供,经鉴定符合《中华人民共和国药典》2020版规定;脑心浸液培养基(Brain heart infusion,BHI,北京索莱宝科技有限公司,315G032);氯己定(Chlorhexidine,CHX,上海麦克林生化科技股份有限公司,C804720);二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO,上海科雅生物科技有限公司,1084ML100);蒽酮试剂(上海麦克林生化科技有限公司,A800666);LDH活性试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,BC0685);钙离子试剂盒(南京建成生物工程研究所,C004-2-1);SYTO 9/ PI活死菌染色试剂盒(上海懋康生物科技有限公司,MX4234);变异链球菌(Streptococcusmutans,UA159)、血链球菌(Streptococcussanguis,ATCC 10556)、黏性放线菌(Actinomycesviscosus,ATCC 19246)均购自广东省微生物培养中心。

1.2 方法

1.2.1 新疆桑白皮提取物的制备 取新疆桑白皮药材粉碎并过筛,用80%乙醇回流提取3次,抽滤并合并3次滤液,将滤液浓缩,冷冻干燥得粉末。根据前期研究结果新疆桑白皮提取物对变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌单菌种生物膜50%最低生物膜抑制浓度(50% Minimum biofilm inhibition concentration, MBIC50)分别为:1.0、1.0、0.5 mg/mL,将新疆桑白皮提取物用含1%DMSO的BHI培养基配制至2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50及1/4倍MBIC50,备用。

1.2.2 3种致龋菌菌悬液的制备 将变异链球菌、血链球菌和黏性放线菌分别接种于BHI琼脂培养基,37℃厌氧培养48 h。挑取3种细菌单个菌落分别在BHI液体培养基中在相同条件下分别过夜培养24 h培养至对数生长期,将3种细菌菌悬液浓度分别调整至108CFU/mL(OD625=0.18)备用。

1.2.3 分组 (1)阴性对照组:不加新疆桑白皮提取物及氯己定;(2)阳性对照(CHX)组:加入0.05%氯己定;(3)实验组:加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50及1/4倍MBIC50浓度新疆桑白提取物。

1.2.4 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜产酸水平的影响 向24孔板中加入1.5 mL BHI培养基(含1%蔗糖),分别加入“1.2.2”项下3种细菌单一菌悬液0.5 mL,培养24 h分别形成3种细菌单一菌株生物膜。吸出每孔中的培养液,用PBS缓冲液洗涤3次,实验组分别加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50浓度新疆桑白皮提取物各2 mL,CHX组加入0.05%氯己定2 mL,阴性对照组加入BHI培养基2 mL(初始pH调至7.2),培养24 h,4℃下,8 000 r/min离心30 min收集上清液,测定pH值,计算ΔpH值=初始pH值-终末pH值。在培养的24 h内,选取1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h时间点测定pH值,绘制3种细菌pH曲线,动态观察新疆桑白皮提取物对3种主要致龋菌单菌种生物膜pH值的变化。

1.2.5 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜产水溶性细胞外多糖(Soluble extracellular polysaccharide , SEPS)及水不溶性细胞外多糖(Insoluble extracellular polysaccharide , IEPS)能力的影响 向24孔板中分别加入1.5 mL的BHI培养基(含1%蔗糖)与3种细菌单一菌悬液0.5 mL,培养24 h分别形成3种细菌单一菌株生物膜。吸出每孔中的培养液,用PBS缓冲液洗涤3次,实验组分别加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50浓度新疆桑白皮提取物提取物各2 mL,CHX组加入0.05%氯己定氯己2 mL,阴性对照组加入BHI培养基2 mL。培养24 h将上清液倒出,用PBS缓冲液洗涤3次,向每个孔中加入500 μL DEPC处理的水,用无菌刀片从底部充分刮取生物膜,将SEPS充分溶解于DEPC处理的水中,4℃下12 000 r/min离心10 min,将沉淀重悬于0.4 mol/L NaOH中,将IEPS充分溶解于NaOH中,4℃下12 000 r/min离心10 min。将240 μL蒽酮硫酸试剂(1 mg蒽酮粉∶1 mL硫酸)与80 μL DEPC处理水(含SEPS)或NaOH溶液(含IEPS)混合,在96℃下加热6 min,冷却至室温后,分别测定OD625值,计算多糖含量。

1.2.6 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜上清液中乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase,LDH)含量的影响 分别将变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌菌悬液各100 μL和100 μL BHI培养基(含1%蔗糖)加入96孔板,37℃下培养24 h形成3种细菌单一菌株生物膜。吸出上清液,用PBS缓冲液洗涤3次,实验组分别加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50浓度新疆桑白皮提取物提取物各200 μL,CHX组加入0.05%氯己定氯己200 μL,阴性对照组加入BHI培养基200 μL,37℃下培养24 h,收集上清液,按LDH检测试剂盒说明书操作测定上清液中LDH含量。

1.2.7 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜上清液中钙离子(Ca2+)浓度的影响 分别将变异链球菌、血链球菌、黏性放线菌菌悬液各100 μL和100 μL BHI培养基(含1%蔗糖)加入96孔板,37℃下培养24 h,形成3种细菌单一菌株生物膜。吸出上清液,用PBS缓冲液洗涤3次,实验组分别加入2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50浓度新疆桑白皮提取物提取物各200 μL,CHX组加入0.05%氯己定氯己200 μL,阴性对照组加入 BHI培养基200 μL,37℃下培养24 h,收集上清液,按Ca2+检测试剂盒说明书操作测定上清液中Ca2+浓度。

1.2.8 3种致龋细菌单菌种生物膜活/死菌染色 将Live/Dead试剂盒中的SYTO 9和PI各1.5 μL加入1 mL生理盐水配制成活/死菌染色试剂,避光4℃保存。实验组分别加入MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50、1/4倍MBIC50浓度新疆桑白皮提取物和3种细菌菌悬液各1 mL分别放入无菌激光共聚焦玻底培养皿中,CHX照组加入氯己定和3种细菌菌悬液各1 mL分别放入无菌激光共聚焦玻底培养皿中,阴性对照组加入3种细菌菌悬液和BHI培养基各1 mL分别放入无菌激光共聚焦玻底培养皿中,37℃下培养24 h,弃去上清液,用PBS缓冲液洗涤3次,加入50 μL的SYTO 9/PI混合染料,于37℃避光静置15 min,吸去多余的染料后,放置于激光共聚焦显微镜下(Confocal laser scanning microscope,CLSM),观察生物膜荧光图像。

2 结果

2.1 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜pH值的影响与阴性对照组比较,实验组(除1/4倍MBIC50实验组)和CHX组生物膜ΔpH值均减小,差异有统计学意义(P<0.05)。与CHX组比较,实验组生物膜ΔpH值均增大,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。由pH曲线可见变异链球菌、血链球菌和黏性放线菌阴性对照组和1/4倍MBIC50实验组的pH值在培养后的2 h开始迅速下降,在培养后的6、8、12 h后下降到5.0以下。 2倍MBIC50、1倍MBIC50、1/2倍MBIC50实验组及CHX组pH值下降幅度较阴性对照组和1/4倍MBIC50实验组降低,2倍MBIC50实验组与CHX组pH值变化幅度最小,见图1。

注: A: 变异链球菌; B: 血链球菌; C: 黏性放线菌。

表1 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜pH值的影响

2.2 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜产IEPS、SEPS能力的影响与阴性对照组比,实验组(除1/4倍MBIC50实验组)和CHX组3种致龋细菌单菌种生物膜产IEPS、SEPS能力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与CHX组比较,实验组3种致龋细菌单菌种生物膜产IEPS、SEPS能力升高,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

2.3 新疆桑白皮对3种致龋细菌单菌种生物膜上清液LDH含量的影响与阴性对照组比较,实验组(除了1/4倍MBIC50实验组)和CHX组上清液中LDH含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CHX组比较,实验组上清液中LDH含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

注: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

2.4 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜上清液Ca2+浓度的影响与阴性对照组比较,实验组(除了1/4倍MBIC50实验组)和CHX组上清液中Ca2+浓度升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CHX组比较,实验组上清液中Ca2+浓度降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

注: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

2.5 新疆桑白皮提取物对3种致龋细菌单菌种生物膜活死菌状态的影响与阴性对照组比较,实验组(除了1/4倍MBIC50实验组)和CHX组生物膜细菌总量下降,死细菌数量增大,活/死细菌比值百分比下降,差异有统计学意义(P<0.05),见图5～8。

注：第1排表示不同处理组活菌成像;第2排表示不同处理组死菌成像;第3排表示不同处理组活死菌合并成像;比例尺为10 μm。

注：第1排表示不同处理组活菌成像;第2排表示不同处理组死菌成像;第3排表示不同处理组活死菌合并成像;比例尺为10 μm。

注: *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。

3 讨论

变异链球菌、黏性放线菌等是主要的致龋菌,通过代谢各种碳水化合物产生酸,将口腔pH值降到5.0以下,利用蔗糖作为底物合成胞内和胞外多糖,与龋病的发生密切相关[16-17]。血链球菌牙菌斑是一种口腔细菌生物膜,最早黏附于牙表面,为其余细菌黏附与定植提供条件。由于生物膜增加了细菌的耐药性,抑制或破坏生物膜对预防和治疗龋病至关重要[18]。与细菌浮游状态相比,细菌生物膜更能适应并生存在复杂的环境中,因为成熟生物膜中的细菌病原体产生EPS,富含EPS的酸性微环境是一个关键的毒力因子,它作为一个三维支架结构具有保护屏障作用,增强了牙菌斑生物膜的致龋潜力[19-20]。尽管在预防龋病方面取得了显著进展,但致龋菌生物膜的治疗仍具有挑战性。

产酸能力作为致龋菌生物膜与龋病发生发展相关最主要原因,致龋细菌能够以蔗糖为底物产酸,使脱矿与再矿化平衡失调,最终致使牙体组织龋坏[21]。因此,控制致龋细菌生物膜产酸是降低致龋细菌致龋能力的有效方法。本实验结果发现新疆桑白皮提取物呈剂量依赖性地抑制上述3种主要致龋菌生物膜状态下产酸能力,随着新疆桑白皮提取物浓度的增加pH值降低,细菌的产酸能力与药物浓度成反比,除了1/4MBIC50组以外其余3组药物浓度下24 h后的pH值高于平衡牙脱矿水平的临界pH值。通过pH曲线动态观察到药物作用后致龋菌产酸能力受抑制作用,进入平台期的时间加快,因此进一步证明新疆桑白皮提取物对生物膜状态下有良好的防龋效果。由特定病原微生物产生的EPS促进了微生物的黏附和粘连,其中IEPS促进细菌的聚集和牙菌斑的聚集,而SEPS是一种可快速代谢的能量储备多糖[21-22]。有研究表明IEPS对于菌斑生物膜的成熟是必不可少的,因为高度黏附的IEPS的存在可增加生物膜机械稳定性,并增加细菌在牙齿表面黏附时间[22]。目前测定多糖含量通常采用蒽酮硫酸法或苯酚硫酸法两种比色法,其中蒽酮-硫酸法可以测定所有的碳水化合物中总多糖含量,对快速测定总多糖含量具有重要意义[23],因此本实验研究采用蒽酮-硫酸法测定新疆桑白皮药物作用下细菌细胞膜外多糖含量的变化,研究结果发现新疆桑白皮对致龋细菌生物膜产IEPS、SEPS能力均有良好的抑制作用,并观察到随着药物浓度的增加IEPS与SEPS的比例下降,主要与其对细菌及生物膜的抑制作用有关。

当细菌细胞膜被破坏或细通透性能发现变化时,LDH会被释放到细胞外即上清液中,上清液中LDH含量随着被破坏的细菌数目的增加而增加,因此LDH活性常用于检测生物膜内的细胞损伤[24]。Ca2+的泄漏也可以用来指示生物膜内的细菌细胞损伤,当细菌细胞膜的完整性被破坏时,上清液中Ca2+的含量就会增加[25]。而本研究通过检测新疆桑白皮提取物作用后生物膜细菌培养液LDH含量和Ca2+浓度,研究结果发现培养液LDH含量和Ca2+浓度与新疆桑白皮药液浓度成正比,说明随着药物浓度的增加药液对生物膜细菌破坏力也增加,结果均表明新疆桑白皮提取物破坏了生物膜结构。本研究使用活/死细菌活力试剂盒来观察生物膜内的细菌活力,结果也显示红色荧光随着药物浓度的增加而增加,特别是在MBIC50或以上,表明细菌细胞膜受损更大,从合并的活细菌图像中还观察到随着药物浓度的增加,黄色更显著,随着药物浓度的增加生物膜所含活死菌比例明显下降,从而降低生物代谢能力,进一步证明新疆桑白皮提取物有良好的杀菌和生物膜形成抑制作用。

综上所述,新疆桑白皮提取物不仅可以抑制主要致龋细菌生物膜的形成、产酸、产糖能力,还能破坏生物膜细菌影响生物膜形态活性。本次研究进一步验证了新疆桑白皮提取物的防龋作用,为龋病的防治提供了一定的实验依据。但本实验存在一些不足,本实验研究新疆桑白皮提取物防龋作用并且研究其对单菌种生物膜作用的研究,因此对混合菌种生物膜作用以及防龋潜在机制分子水平有待进一步研究。