血清HBV RNA在临床应用中尚未解决的关键科学问题

黎婉莹 申笙 刘诗 孙剑

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后引起的慢性肝脏疾病。据估计,全球约有2.96亿的慢性HBV感染者,占总人口的3.8%[1]。而我国是HBV感染的中高流行地区,现有慢性HBV感染者7500万例,占全球慢性HBV感染者人数的1/3[2, 3]。近年来,血清HBV RNA作为CHB的新型病毒学标志物备受关注,我国的《慢性乙型肝炎防治指南(2022 年版)》以及欧洲肝病学会2017年的指南均提出血清HBV RNA在临床上应用于预测停药后复发的可能性[4, 5],2022年我国发表的血清HBV RNA专家共识也总结了目前血清HBV RNA在临床应用中的进展[6]。然而,在血清HBV RNA广泛应用于临床实践之前,仍有一些关于血清HBV RNA的关键问题亟待解决,本文梳理出三个方面的关键科学问题:(1)缺乏标准化、经多方验证并被广泛认可的血清HBV RNA检测方法;(2)血清HBV RNA可较好地反映肝内共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)遗传组成,但在反映cccDNA拷贝数和转录活性方面仍有局限性;(3)HBV 前基因组RNA(pregenome RNA,pgRNA)与HCC相关性已得到初步证实,但其是否驱动HCC的发生、发展仍未明确。

一、关键问题一:缺乏标准化、经多方验证并被广泛认可的血清HBV RNA检测方法

血清HBV RNA目前缺乏统一标准化的检测方法,主要有以下原因:第一,血清HBV RNA的种类较为复杂,研究表明其主要为pgRNA,包括全长的pgRNA、内含子缺失的剪接型pgRNA以及3’截断型的pgRNA,此外还有少量HBx相关转录本等[7, 8]。当前难以建立一种可以覆盖所有种类的HBV RNA定量方法,而且尚不清楚不同种类的血清HBV RNA的临床应用价值是否一致。第二,不同实验室采用的实验方法不同,包括核酸提取方法、引物和探针位置的设计以及定量技术等,导致不同平台建立的方法检测的血清HBV RNA种类、检测性能、检测结果等不尽一致。国内外不同平台所建立的血清HBV RNA定量检测方法主要有基于cDNA末端快速克隆的PCR法(rapid amplification of cDNA ends PCR,RACE-PCR)、逆转录-实时荧光定量PCR法(reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)、微滴数字PCR法(droplet digital PCR,ddPCR)和RNA实时荧光恒温扩增检测技术等多种方法[9-12]。第三,目前尚缺乏血清HBV RNA国际标准品,使得国内外所建立的血清HBV RNA定量方法无法进行直接比较和均一化。我们团队前期研究表明,不同检测方法,定量的血清HBV RNA水平不尽一致,而且不同方法定量结果之间的差异在不同人群中也不尽相同[13]。尽管不同方法定量的结果对抗病毒治疗后乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)血清学转换的预测效能相当,但最佳截断值却是不同的,且不同方法对核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]停药后复发的预测效能也不尽一致,说明了在临床实践中,在未出现标准统一的血清HBV RNA定量检测方法或国际标准品之前,难以规范不同检测方法在指导CHB 临床诊疗中的应用条件。

因此,为了推动血清HBV RNA在临床上的应用,未来的策略是建立一个检测性能和临床应用效能优异且稳定、易于推广应用的血清HBV RNA定量方法。该方法应经过国内外不同的大型前瞻性临床队列进行多方验证,并广泛认可其临床应用效能,如稳定有效地预测抗病毒治疗应答、NAs停药后复发和预测肝细胞癌发生、发展等。只有定量的结果具有稳定的临床应用价值,才是当前临床上亟需的血清HBV RNA定量方法,并且可以基于此方法,对其他平台所建立的方法进行标准化,从而推动血清HBV RNA在临床上的广泛应用,进一步优化CHB临床诊疗与管理策略。

二、关键问题二:血清HBV RNA可较好地反映cccDNA遗传组成,但在反映cccDNA拷贝数和转录活性方面仍有局限性

检测肝内cccDNA的数量和转录活性可准确反映CHB患者机体内病毒活性和评估药物的抗病毒效果,但cccDNA的检测需要进行有创的肝活检,极大地阻碍了其在临床上的应用。因此,亟需寻找可有效反映肝内cccDNA状态的无创标志物。HBV病毒颗粒感染肝细胞后,部分双链环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)在肝细胞核内修复形成cccDNA。cccDNA作为原始模板可以转录成不同类型的HBV RNA,其中pgRNA在进入细胞质后,一方面会翻译成聚合酶蛋白和核心蛋白,另一方面,pgRNA作为逆转录模板形成rcDNA,而未被逆转录的pgRNA以裸衣壳形式或者被乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)包装成病毒样颗粒分泌出胞[14]。因此,理论上血清HBV RNA作为肝内cccDNA的直接下游产物,可有效反映其遗传组成、拷贝数以及转录活性。

我们团队前期研究表明,CHB患者血清HBV RNA可准确反映肝内cccDNA的遗传组成。在HBV复制过程中,由于病毒逆转录酶缺乏校对功能,HBV突变主要发生在pgRNA逆转录为rcDNA这一环节。携带突变rcDNA可进一步合成突变型的cccDNA,接着转录生成突变型的HBV RNA。因此,我们创新性地以拉米夫定耐药突变位点(rtM204I/V)的突变作为血清HBV DNA、RNA和肝内cccDNA的遗传标记,同时检测CHB患者血清HBV DNA、RNA和肝内cccDNA的rtM204I/V突变比率并进行相关性分析,发现肝内cccDNA的 rtM204I/V突变比率与血清HBV RNA的突变比率高度相关(r=0.96,P=0.0001),但与HBV DNA的突变比率无相关性[15],表明了血清HBV RNA是准确反映肝内cccDNA遗传组成的重要无创标志物。

在反映cccDNA拷贝数和转录活性方面,血清HBV RNA在不同疾病阶段的CHB患者中的表现不尽相同。在初治患者中,有研究发现血清HBV RNA与cccDNA拷贝数呈弱相关性(r=0.25～0.36)[16, 17],但也有研究报道二者相关系数高达0.59～0.78[18, 19]。不同研究报道的结果不尽一致,可能与不同研究的人群临床特征差异性大以及当前血清HBV RNA与肝内cccDNA的提取与检测方法还未完善、统一相关。对于NAs治疗后的患者,一项小样本量研究(HBeAg阳性14例,HBeAg阴性17例)报道,血清HBV RNA水平与cccDNA拷贝数不存在相关性,但与cccDNA转录活性(胞内HBV RNA与cccDNA的比值)显著相关(r=0.584,P=0.001)[20]。对于PEG-IFN-α治疗患者,一项纳入30例经PEG-IFN-α治疗48周的HBeAg阳性患者的研究显示,血清HBV RNA与cccDNA具有中度相关(r=0.728,P<0.001)[18]。但由于Peg-IFN-α一方面可以直接降解cccDNA、HBV RNA[21, 22],另一方面也能通过沉默cccDNA间接下调HBV RNA水平[23],因此Peg-IFN-α治疗后两者的相关性仍需要更多研究明确。综上所述,对于自然史患者,血清HBV RNA可以一定程度上反映cccDNA水平,但在反映cccDNA转录活性方面的证据仍欠缺;对于经治患者,目前的证据不足以支持血清HBV RNA可较好地反映cccDNA拷贝数和转录活性,仍需大样本量、包含不同治疗手段的治疗史队列进一步明确。

三、关键问题三:HBV pgRNA与HCC相关性已得到初步证实,但其是否驱动HCC的发生、发展仍未明确

近期,我们在一项大样本量、前瞻性、观察性的长期随访抗病毒治疗CHB队列中发现,血清HBV RNA水平与CHB患者HCC发生风险独立相关,表明血清HBV RNA水平与血清HBV DNA水平类似,也是能反映CHB疾病进展的血清标志物[24]。有意思的是,最近的一项研究显示,对于接受长期NAs治疗且血清HBV DNA检测不到的患者,血清pgRNA水平高者的总生存率较差,肝癌切除后累积复发率较高。这项研究的体内外实验显示,HBV pgRNA自身能直接通过系列机制促进肝癌细胞的恶性表型[25]。由此我们不禁思考,HBV pgRNA在CHB疾病进展过程中所扮演的究竟是一个风险标志物,还是一个疾病进展直接驱动因素的角色?

目前主流观点认为HBV病毒本身直接促进HCC发生的主要机制有以下三种:(1)通过将病毒DNA整合到宿主癌基因(如TERT和CCNE1等)中,导致癌基因表达上调[26, 27];(2)病毒DNA的整合以及病毒蛋白的表达导致宿主基因组的不稳定性[28];(3)野生型和突变/截短病毒蛋白(HBx、HBc和preS)影响细胞功能,激活致癌信号通路并使肝细胞对诱变因素敏感[28]。既往没有文献表明HBV pgRNA自身具备直接促进HCC发生、发展的功能,仅有部分文献显示HBV pgRNA的一些剪接变异体能够翻译形成某些功能蛋白,这些功能蛋白能促进HCC发生、发展[29, 30]。因此研究HBV pgRNA是否具有直接促进HCC发生的生物学效应之前,也需要排除这些功能蛋白的影响。

探讨HBV pgRNA自身是否具有直接促进HCC发生、发展作用,还有以下几个方面值得深入探讨:(1)大多数慢性HBV感染者从感染HBV到形成HCC需要经历较为漫长的慢性肝炎和肝硬化阶段,这也是HBV相关HCC发生、发展的主要驱动因素。而从HBV感染自然史来看,大多数患者也需要经历时间较长的HBeAg阳性慢性感染(免疫耐受)阶段,在该阶段患者肝内病毒复制活跃,有巨量的HBV pgRNA存在,无明显或只有轻微炎症和纤维化,而HCC发生的风险反而较低[31, 32]。尽管HCC发生是多因素共同作用的结果,但如果HBV pgRNA自身具有直接促进HCC发生的生物学效应,那么如何用这种效应去解释自然史不同阶段HCC发生风险上的差异?这种效应与肝脏炎症和纤维化等因素间具有何种内在联系?(2)肝细胞内HBV pgRNA主要有三条去路:1)HBV pgRNA被降解;2)通过逆转录合成HBV DNA;3)以病毒颗粒或裸衣壳包裹等形式分泌出胞。抑制其中一条去路将可能导致胞内HBV pgRNA蓄积增多。目前,各类临床试验在研的HBV衣壳抑制剂能抑制pgRNA包装,从而减少其逆转录合成HBV DNA。目前尚未发现衣壳抑制剂对肝细胞内pgRNA水平的影响[33],那么衣壳抑制剂治疗是否会导致肝内pgRNA水平升高进而增加HCC发生的风险,这值得通过体内外实验进行探究。(3)HBV cccDNA不仅转录pgRNA,还转录3.5 kb长度的precore mRNA。从序列上看,precore mRNA仅在5’端略长于pgRNA,二者的其余序列完全一致,如果pgRNA能直接驱动HCC发生、发展,那么precore mRNA是否也存在类似功能?这也值得通过体内外实验进行探究。

综上所述,我们认为HBV pgRNA是否具有直接促进HCC发生的生物学作用仍需要更多的实验和临床数据进行论证。从已发表的文献来看,血清HBV RNA更多是扮演反映HCC发生风险的血清标志物的角色。需要注意的是,在NAs治疗下,血清HBV DNA被抑制转阴而血清HBV RNA仍检测阳性,提示了肝内cccDNA仍有较高的转录活性,这样的患者仍有相对较高的HCC发生风险。

四、总结与展望

总体来说,血清HBV RNA作为新型病毒学标志物,已经在预测NAs停药后复发、预测IFN治疗应答和监测肝脏疾病进展等方面体现了潜在的应用价值。但在进一步广泛应用于临床实践之前,开发经过不同人群的队列验证并被广泛认可的血清HBV RNA提取和检测方法是亟待解决的关键问题之一。在临床应用方面,血清HBV RNA作为cccDNA的下游产物,可以较好地反映cccDNA遗传组成,但在反映cccDNA的拷贝数和转录活性上有待在更大样本量和不同临床场景中研究。近年有研究发现,血清HBV RNA可预测HCC发生风险,但HBV RNA本身是否具有直接的促癌作用仍需要进行更深入的临床和基础研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：黎婉莹、刘诗和申笙负责撰写论文及文献收集;孙剑负责拟定写作思路,指导撰写文章并最后定稿。