芜菁酸性多糖体内抗肿瘤活性研究

古丽米拉·卡德尔

阿曼妮萨·麦提如则1

李明珠1

康金森1

海力茜·陶尔大洪1,2,3

(1. 新疆医科大学药学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2. 新疆及中亚特色医药资源教育部工程研究中心,新疆 乌鲁木齐 830011;3. 新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830011)

芜菁(BrassicarapaL.)又名恰麻古、蔓菁,属于十字花科芸薹属植物,以块根入药,富含多糖[1]。芜菁多糖具有润肺、开胸理气的功效[1],还具有抗氧化[2-3]、抗衰老[4]、抗肿瘤[5]、抗疲劳[6]等作用。已有研究表明,芜菁酸性多糖在体内具有抗Lewis肺癌活性[7];芜菁多糖有降血糖作用[8],对LPS/ATP诱导的RAW264.7细胞焦亡具有抑制作用[9];芜菁中性多糖能够抑制LDH的生成、提高抗氧化酶活性、上调凋亡蛋白表达水平,改善PC12细胞氧化应激损伤[10],能有效提高D-半乳糖致衰老小鼠模型抗氧化能力,达到延缓衰老的作用[11]。

非小细胞肺癌是常见的一种肺癌类型。据调查[12-14],非小细胞肺癌的发病率和致死率均占恶性肿瘤的首位,传统治疗效果不理想、不良反应多,严重影响患者的生活质量。研究[15]表明,细胞坏死性凋亡可能在癌症中发挥重要作用,作为一种肿瘤抑制效应,坏死性凋亡可作为一种“故障安全”机制,在细胞凋亡受到损害时防止肿瘤发展。在坏死性细胞死亡过程中,坏死性凋亡导致细胞器肿胀、细胞膜破裂及其内容物渗漏到细胞间隙中[16-17]。但与坏死不同的是,坏死性凋亡中的细胞裂解受到严格调控,其关键调控分子包括受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、RIPK3和混合谱系激酶域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like proteins,MLKL),它们共同形成一个复合物激活坏死性凋亡通路[18]。

研究拟采用人H226细胞建立荷瘤小鼠模型,通过体内试验分析芜菁酸性均一多糖对荷瘤小鼠血清中白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)细胞因子水平、肿瘤组织中坏死性凋亡相关基因表达情况的影响,进一步阐明芜菁酸性均一多糖体内抗肿瘤活性及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

芜菁:采自新疆阿克苏柯坪县;

4～6周龄BALB/c裸鼠:湖南斯莱克景达实验动物有限公司;

H226细胞株、细胞增殖毒性检测试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)、缓冲液(PBS):武汉普诺赛生命科技有限公司;

顺铂:北京索莱宝科技有限公司;

DMEM培养基:美国Gibco公司;

0.25%胰蛋白酶:美国Gibco公司;

胎牛血清(FBS):南京生航生物技术有限公司;

TB Green qPCR试剂盒:日本Takara Bio公司;

酶联免疫试剂盒:武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;

氯化钠注射液:四川科伦药业股份有限公司;

二抗:美国Affinity公司;

MLKL、RIP1、RIP3抗体:兔抗,英国Abcam公司;

GAPDH抗体:兔抗,武汉赛维尔生物科技有限公司;

倒置显微镜:IX71-12FL/PH型,赛默飞世尔科技公司;

离心机:5424R型,德国Eppendorf公司;

二氧化碳培养箱:Galaxy 170R型,赛默飞世尔科技公司;

荧光定量PCR仪:Quant Studio 6Fle型,美国ABI公司;

电热恒温水槽:SSW-600-2S型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;

电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9023A型,上海精宏实验设备有限公司;

全波长酶标仪:TECAN F50型,赛默飞世尔科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芜菁酸性多糖提取物制备 芜菁酸性多糖(BrassicarapaL. acid polysaccharides,BRAP)一组分和二组分(BRAP-1、BRAP-2)按课题组前期优化条件提取、分离、纯化、除蛋白后得到[9],BRAP-1平均相对分子质量为6 080,糖醛酸含量为28.13%,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成,摩尔比为2.07∶4.53∶2.20∶1.00;BRAP-2平均相对分子质量为7 590,糖醛酸含量为20.80%,由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成,摩尔比为1.06∶1.00∶5.03∶2.22∶1.50[4]。

1.2.2 CCK-8法检测芜菁酸性多糖对H226细胞增殖情况的影响 取对数生长期的H226细胞,调整细胞密度为5×104个/mL,将细胞100 μL/孔接种于96孔细胞培养板中,设置空白组、对照组、BRAP-1/BRAP-2各剂量给药组。37 ℃恒温培养箱培养细胞24 h至细胞贴壁,给药24 h后吸弃上清液,每组加100 μL完全培养液和10 μL CCK-8试剂,在37 ℃恒温培养箱中孵育1～2 h后用酶标仪于450 nm处测定其OD值[5]。

1.2.3 H226细胞荷瘤小鼠模型的建立、分组及给药情况

取对数生长的人肺鳞癌H226细胞,调整细胞浓度为1×107个/mL,将细胞悬液150 μL/只皮下注入到小鼠右腋上侧。造模成功后进行分组,分组情况:正常对照组、模型组,阳性药物顺铂组[3 mg/(kg·2 d)],BRAP-1低剂量组[50 mg/(kg·d)],BRAP-1中剂量组[100 mg/(kg·d)]和BRAP-1高剂量组[200 mg/(kg·d)],每组10只,腹腔注射给药[19-20]。

1.2.4 肿瘤体积、抑瘤率及脾脏指数的计算 给药当天开始每隔1 d测量活体肿瘤的大小(肿瘤的最大长径a和最小短径b),给药结束第2天处理小鼠,眼球采血收集血清、肿瘤、脾脏等,肿瘤体积、抑瘤率及脾脏指数计算公式:

v=a×b2/2,

(1)

(2)

(3)

式中:

v——肿瘤体积,cm3;

a——肿瘤最大长径,cm;

b——肿瘤最小短径,cm;

c1——抑瘤率,%;

s——脾脏指数,mg/g;

m1——给药组平均瘤重,g;

m2——模型组平均瘤重,g;

m3——脾脏质量,mg;

m4——小鼠体质量,g。

1.2.5 ELISA法检测小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ含量 小鼠全血静置2 h,离心分离血清(4 ℃,1 200 r/min,20 min)-80 ℃的冰箱保存。根据试剂盒说明书检测荷瘤小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ的含量。

1.2.6 RT-RCR法检测小鼠肿瘤组织中IL-18、IL-1β、MLKL、RIP1、RIP3RNA表达量 提取各组小鼠肿瘤中的RNA[22-24],按TB Green q-PCR试剂盒说明书操作。引物设计如表1所示。

表1 引物序列

1.2.7 Western Blot法检测小鼠肿瘤组织中MLKL、RIP1、RIP3蛋白表达量 提取各组小鼠肿瘤中的蛋白[25-28],经蛋白定量、制胶并上样、电泳、电转后,将涂布显影液的PDVF膜曝光后保存图片。

1.2.8 统计分析 采用SPSS、Origin 2022软件进行数据分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 BRAP-1、BRAP-2对H226细胞增殖率的影响

如图1所示,BRAP-1对H226细胞增殖率的影响显著,随着给药质量浓度从1 μg/mL增加到5 000 μg/mL,H226细胞增殖率逐渐降低,呈剂量依赖性[7]。相比BRAP-1,BRAP-2对H226细胞增殖率的影响较小,1 μg/mL干预细胞后增殖率仍较高,而在50～5 000 μg/mL的质量浓度范围内,各组干预浓度虽有明显差别,但对H226细胞增殖率的影响相近。BRAP-1对H226细胞的增殖有更显著的抑制作用,可能是BRAP-1糖醛酸含量较高相对分子质量较小,有利于其发挥抗炎抗肿瘤作用[29],因此后续动物试验以BRAP-1给药。

图1 BRAP-1、BRAP-2质量浓度对H226细胞增殖率的影响

2.2 BRAP-1对H226细胞荷瘤小鼠肿瘤质量的影响

各组荷瘤小鼠抑瘤率从高到低依次为:阳性组>BRAP-1高剂量组>BRAP-1中剂量组>BRAP-1低剂量组。如图2所示,随着BRAP-1给药剂量的增加,小鼠肿瘤生长出现迟缓现象,相比模型组,阳性组抑瘤效果显著(P<0.01)、BRAP-1中、高剂量组均可减缓肿瘤生长速度,差别有统计学意义(P<0.05)。BRAP-1可能通过破坏肿瘤生长微环境、免疫细胞胞间复杂的相互作用网络发挥抗肿瘤作用,抗肿瘤作用呈剂量依赖性[30-31]。

与模型组比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.3 BRAP-1对H226细胞荷瘤小鼠体重的影响

阳性组小鼠体重下降,可能是化疗药物顺铂在抑制肿瘤的过程中使荷瘤小鼠的食欲减退等毒副作用引起的。与阳性组相比,BRAP-1各剂量组荷瘤小鼠的体重前后变化较小,说明BRAP-1对小鼠毒副作用甚少,可在尽量不损伤机体正常组织的情况下防治肿瘤进一步发展,这便是植物多糖BRAP-1优势所在(图3)。

图3 BRAP-1对H226细胞荷瘤小鼠体重的影响

2.4 BRAP-1对H226细胞荷瘤小鼠脾脏指数的影响

与对照组相比,阳性药顺铂组小鼠脾脏指数均降低显著(P<0.01),BRAP-1各剂量给药组的脾脏指数均有所增加,差异有统计学意义(P<0.05),其中低、中、高剂量组间无显著差异(图4)。脾脏是免疫细胞居住的场所,属于外周免疫器官,也是血液循环系统中重要的过滤器官,可清除血液内的病原体、衰亡的血细胞等[32-33]。机体免疫功能表现亢进或抑制时,脾脏细胞也相应的增殖或萎缩,因此,脾脏指数可在一定程度上体现BRAP-1对机体免疫功能的影响[34]。

与对照组比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.5 H226细胞荷瘤小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ含量

模型组小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ的含量均显著增加,阳性组小鼠血清中IL-18、TNF-ɑ的含量与模型组相比有降低趋势,而BRAP-1各组血清中细胞因子水平具有增长趋势。阳性组和BRAP-1高剂量组的IL-1β明显增加(P<0.05),而BRAP-1低、中剂量组小鼠血清中IL-1β含量均比模型组低(表2)。

表2 BRAP-1对H226细胞荷瘤小鼠血清中IL-18、IL-1β、TNF-ɑ含量的影响†

有研究[29]表明,肿瘤坏死因子、白介素对肿瘤的增殖、发展具有重要作用。当IL-1β、IL-18被消除时,肿瘤生长会延迟。但IL-1β、IL-18在肿瘤发生中既可以是协作关系,也可以是对立关系,具体取决于肿瘤类型和背景。在一项肺癌细胞系研究[30]中,IL-1β可通过刺激炎症介质(如IL-6、IL-8等)促进肿瘤转移,还会增加乳腺癌细胞的侵袭性;TNF-α主要由活化的巨噬细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生,其在一些细胞中的表达较低,包括成纤维细胞、平滑肌细胞和肿瘤细胞。综上,BRAP-1可通过调节肿瘤相关细胞因子水平发挥抗肿瘤作用。

2.6 H226细胞荷瘤小鼠肿瘤中IL-18、IL-1β、MLKL、RIP1、RIP3 mRNA表达量

与模型组比较,阳性药顺铂组小鼠肿瘤组织中IL-18、MLKL、RIP1、RIP3mRNA表达水平显著升高(P<0.01),IL-1βmRNA表达量减小(P<0.05);BRAP-1组小鼠肿瘤组织中MLKL、RIP1、RIP3mRNA表达水平显著升高(P<0.01),表明BRAP-1可激活坏死性凋亡通路,导致其关键因子基因转录水平升高(图5)。坏死性凋亡受MLKL、RIP1、RIP3的调控,研究[35-36]表明,癌组织中RIPK1和RIPK3的表达量显著低于周围正常组织,此外,肿瘤中RIPK3和MLKL表达的降低与较差的总体生存率显著相关。BRAP-1可通过上调MLKL、RIP1、RIP3基因的表达,促进肿瘤细胞发生坏死性凋亡,从而阻遏肿瘤细胞的进一步增殖及癌症的继续发展。

与模型组比较,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.7 H226细胞荷瘤小鼠肿瘤中MLKL、RIP1、RIP3蛋白表达量

感染、组织损伤、炎症和癌症都会导致MLKL、RIP3表达升高,虽然RIP1、RIP3是MLKL的上游蛋白,但在许多细胞系和组织中MLKL可在缺乏RIP3的情况下表达[37]。与模型组比较,阳性药顺铂组小鼠肿瘤组织中MLKL、RIP1蛋白表达水平显著升高,RIP3蛋白表达量无明显差别;BRAP-1组小鼠肿瘤组织中MLKL、RIP1、RIP3蛋白表达水平显著升高,可见BRAP-1通过激活坏死性凋亡通路发挥抗肿瘤作用(图6)。

从左到右分别为模型组、阳性药组、BRAP-1低剂量组、BRAP-1中剂量组、BRAP-1高剂量组

3 结论

芜菁酸性多糖一组分可控制H226细胞荷瘤小鼠肿瘤生长,升高脾脏指数及荷瘤小鼠血清中的白细胞介素18、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α细胞因子水平,上调MLKL、RIP1、RIP3基因及其蛋白的表达。通过调控MLKL/RIP1/RIP3坏死性凋亡通路,促进肿瘤细胞发生坏死性凋亡,从而抑制癌细胞增殖发挥抗肿瘤作用。