限制性酶解结合糖基化改性对大豆分离蛋白乳化性质的影响

李 琳

孙一熙

秦 文

张 清

(四川农业大学食品学院,四川 雅安 625099)

大豆蛋白作为大豆中最主要的营养成分,是一种产量高、价格低廉的优质植物蛋白资源[1-2],主要优点包括:① 氨基酸组成方面具有优势,包含所有必需氨基酸;② 含有生物活性物质,能降低胆固醇,减少高脂血症和心血管疾病发生的风险;③ 具有极好的加工性能,如凝胶性、乳化性和持水持油性[3-4]。在各种功能性质中,对大豆蛋白的乳化特性研究最为广泛。然而,天然大豆蛋白的乳化性会受到各种环境因素的影响,限制了其在食品工业中的应用。因此,通常需要对天然大豆蛋白进行改性处理。

目前,常用的蛋白质改性方法主要有物理改性、化学改性和酶法改性3种[5]。协同改性是将两种或两种以上的改性方法协同作用,可有效克服单一改性方法的局限性以及不足。Jiang等[6]分别用胃蛋白酶和胰蛋白酶对乳清蛋白—半乳糖轭合物进行水解处理,结果发现,水解后轭合物的抗氧化活性较水解前显著提高。Song等[7]用碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白—壳聚糖轭合物,得到水解度为1%,2%,4%的水解产物,结果发现,与天然蛋白和经轭合的蛋白相比,其结构更灵活,乳化性和抗氧化活性更高。Zhang等[8]研究了有限水解对大豆分离蛋白—麦芽糊精轭合物物理化学性质的影响,结果发现,有限的水解可以改善轭合物的结构,提高其乳化活性。除了将蛋白质—多糖轭合物进行酶解外,对蛋白质的酶解物进行糖基化处理也能使天然蛋白功能性质得到提升。Li等[9]研究发现,与大米蛋白—葡聚糖轭合物相比,大米蛋白水解物(水解度为5%)—葡聚糖轭合物的溶解度、乳化性和乳化稳定性分别提高了3.5,5.3,7.3倍,与大米蛋白水解物相比,分别提高了1.5,2.2,8.0倍。Yu等[10]研究发现,胰蛋白酶水解结合葡聚糖糖基化处理的大豆分离蛋白乳液在经过3次冻融循环后,表现出比未处理的蛋白乳液更高的稳定性,且较低水解度(2%)的糖基化水解物比较高水解度(5%)的糖基化水解物表现出更优的乳化性能。

糖基化处理与酶解处理协同改性对天然蛋白质的结构与功能特性改善效果优异,在开发新型蛋白基食品配料方面有广泛的发展前景。目前,对食品蛋白先进行糖基化处理再酶解的研究相对较多[6-8],而先酶解后糖基化处理的报道较少[9-10]。研究以大豆分离蛋白(soybean protein isolate,SPI)为原料,采用中性蛋白酶对SPI先进行限制性酶水解,再利用超滤处理将酶解SPI分成不同相对分子质量的组分,对每个组分进行糖基化改性,考察改性后产物的乳化特性,旨在为开发基于SPI的新型乳化剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白:蛋白质含量≥85%,水分含量≥7%,灰分≤15%,pH 6.5～7.5,北京索莱宝科技有限公司;

中性蛋白酶:来源于枯草芽孢杆菌,EC编号3.4.24.4,100 U/mg,上海源叶生物科技有限公司;

葡聚糖:相对分子质量为4 000,上海源叶生物科技有限公司;

其余试剂:分析纯,成都市科隆化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

台式高速冷冻离心机:RJ-TGL-2000R型,无锡市瑞江分析仪器有限公司;

恒温恒湿培养箱:LHS-080型,郑州生元仪器有限公司;

荧光酶标仪:Varioskan Flash型,赛默飞世尔科技有限公司;

高速剪切均质机:AD500S-H型,上海昂尼仪器仪表有限公司;

动态光纳米粒度电位仪:Nano ZS型,英国马尔文仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI酶水解处理 根据Huang等[11]的方法修改如下:利用超纯水配制5 g/100 mL的SPI溶液,室温下磁力搅拌2 h,置于4 ℃冰箱水合过夜。在55 ℃条件下,加入中性蛋白酶(0.5 g/100 g),恒温振荡(120 r/min)水解20 min。水解前先将SPI溶液在55 ℃恒温振荡水浴锅中平衡30 min,水解过程中用1 mol/L NaOH溶液控制体系pH在7左右。水解完成后,将蛋白水解液置于90 ℃下加热20 min灭酶。冷却至室温后于4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min,收集上清液,一部分冷冻干燥后得到SPI水解物(soybean protein isolate hydrolysate,SPIH),置于-20 ℃保存备用。

1.3.2 SPIH超滤分离处理 根据Zhang等[12]的方法修改如下:将收集的另一部分上清液经过0.45 μm水相滤膜微滤后,使用不同截留相对分子质量(3 000和1 000)的超滤离心管按照相对分子质量从高到低逐级超滤分级(4 000 r/min,20 min),将SPIH分成相对分子质量不同的3种组分:>3 000(F30)、3 000～1 000(F30-10)和<1 000(F10)。收集滤液,冷冻干燥后置于-20 ℃保存备用。F30、F30-10和F10的得率分别为15.31%,3.94%,0.84%。

1.3.3 SPIH超滤组分糖基化处理 根据Xue等[13]的方法修改如下:利用超纯水配制2 g/100 mL的不同相对分子质量的水解物组分(F30、F30-10和F10)的分散液,加入同等质量的葡聚糖,混匀后室温搅拌2 h,置于4 ℃冰箱中过夜。将混合液冷冻干燥后得到的粉末,置于培养皿中,在60 ℃、相对湿度79%的恒温恒湿培养箱中反应2,4,6,12,18,24 h后取出,迅速冷却以终止反应。冷冻干燥48 h,得到F30/F30-10/F10-葡聚糖轭合物,-20 ℃保存备用。主要考察水解物中不同组分的糖基化后乳化性质的改善情况,因此未对水解物整体进行糖基化改性处理。

1.3.4 乳液制备 将样品分散于超纯水中,配制1,2,3 g/100 mL蛋白质溶液,用0.5 mol/L NaOH或HCl溶液调pH至7,室温下搅拌2 h,置于4 ℃冰箱水合过夜。将充分水合的样品溶液在室温下平衡30 min后,加入大豆油,使最终油相体积分数为10%。在油水混合液中添加0.02 g/100 mL叠氮钠后在12 000 r/min条件下高速均质2 min,制得粗乳液。再将粗乳液在60 MPa下高压均质3次后制得细乳液。

1.3.5 乳化性质测定 乳化活性指数(emulsifying activity index,EAI)和乳化稳定性指数(emulsifying stability index,ESI)的测定根据Xu等[14]的方法修改如下:利用10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)配制1 g/100 mL的样品溶液,漩涡振荡后于4 ℃冰箱中水合过夜。测试前将样品溶液在室温下平衡30 min,按最终油相体积分数为10%加入大豆油。将混合液在12 000 r/min下高速均质2 min。在均质后的第0 min和第10 min从容器底部取50 μL乳液,与5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液混合,在500 nm处测定吸光值。以SDS溶液为空白对照。根据式(1)和式(2)计算EAI和ESI。另外,用胶头滴管吸取上述新鲜制备的乳液滴于洁净的载玻片表面,将盖玻片缓缓覆盖液滴,避免出现气泡。采用光学显微镜观察乳液的微观结构并拍照。

(1)

(2)

式中:

EAI——乳化活性指数,m2/g;

ESI——乳化稳定性指数,min;

A0、A10——乳液在第0 min和第10 min时的吸光度值;

DF——稀释倍数,100;

c——蛋白质量浓度,g/mL;

φ——油相体积分数,%;

θ——光路,1 cm。

1.3.6 乳液粒径和电位测定 乳液用超纯水稀释600倍,设置分散剂的折射率为1.590,吸收系数为0.010。将稀释液放入粒度仪样品池中,在25 ℃下平衡2 min后,测定光强平均粒径及ζ-电位。

1.3.7 乳液稳定性测定

(1) 贮藏稳定性:取4 mL新鲜乳液(pH 7)移入带盖玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中静置贮藏7 d。在第0,1,3,5,7天时,对每个样品的粒径和电位进行分析。

(2) pH稳定性:用0.5 mol/L NaOH或HCl溶液将新鲜乳液的pH值调至3,5,7,9。取4 mL不同pH值的乳液移入带盖玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中静置贮藏24 h后,对乳液的粒径和电位进行分析。

(3) 离子强度稳定性:向新鲜乳液(pH 7)中加入不同质量的NaCl,调整乳液的离子浓度为0,50,100,200 mmol/L。取4 mL不同离子浓度的乳液移入带盖玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中静置贮藏24 h后,对乳液的粒径和电位进行分析。

(4) 温度稳定性:取4 mL新鲜乳液(pH 7)移入带盖玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,置于不同温度(30,50,70,90 ℃)水浴锅中加热30 min。加热后,立即取出冰水浴冷却至室温。随后在4 ℃冰箱中静置贮藏24 h后,对乳液的粒径和电位进行分析。

1.3.8 乳液的复溶性 将新鲜乳液冷冻干燥,取冻干粉末溶解于超纯水(pH 7.0)中,质量浓度为0.4 g/100 mL。将复溶后的乳液移入带盖玻璃瓶(18 mm×40 mm)中,在4 ℃冰箱中静置贮藏24 h后,对乳液的外观进行拍照。

1.4 数据处理

所有试验均进行3次平行重复测定。试验结果以平均值±标准偏差表示,采用Microsoft Office Excel 2019对试验数据进行统计分析,用SPSS 25.0软件进行显著性差异分析,采用Origin 9.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 乳化性质分析

由表1可知,与SPI相比,SPIH的EAI显著增加,但ESI却略微降低。这可能是SPI在酶解后形成了比SPI相对分子质量小的产物,具有更疏松的结构[15],有利于其在油—水界面的快速吸附。同时,酶解也降低了蛋白质的分子质量和溶液黏度,使得SPIH重力分离的速度增加,因此SPIH稳定乳液的稳定性降低[16]。超滤后,与SPIH相比,F30的EAI有所降低,但仍高于SPI。而F30-10和F10的EAI则显著降低,是因为F30-10和F10相对分子质量更低,不能在油—水界面形成连续的蛋白膜,从而表现出较差的乳化性能[17]。

表1 SPI、SPIH、F30、F30-10和F10的乳化性质†

如表2所示,F30经糖基化改性后,随着反应时间的增加,其EAI和ESI呈先上升后下降的趋势,分别在反应6,12 h时达到最高值。EAI和ESI提高的原因分析如下:① 与多糖亲水基团的共价结合增加了F30的亲水性,使其表面性质更活跃,在油—水界面上更容易吸附重排;② 多糖分子链的接入增加了F30的空间位阻,可以防止新形成的液滴聚集,提高乳液稳定性[18]。反应时间延长至18～24 h时,F30-葡聚糖轭合物的ESI开始下降,可能与过高的糖基化反应程度有关。此外,糖基化改性未能改善F30-10和F10的乳化能力。

表2 F30、F30-10和F10反应不同时间的轭合物的乳化性质†

图1是SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的微观结构,可以看出乳液的液滴均呈现规则的球形。SPI、SPIH及F30 3种样品稳定的乳液分布着大小不均匀的液滴,并且由SPIH稳定的乳液液滴尺寸更小。在F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液中,反应4 h的产物稳定乳液的液滴最小,且大小分布趋于均匀。此时,液滴间隙小,依靠紧密,使得水相不容易下流而导致油水分层,同时也会提升乳液稳定性[19]。图2和图3显示了F30-10和F30-10-葡聚糖轭合物,以及F10和F10-葡聚糖轭合物稳定乳液的微观结构,可以看出所有样品稳定乳液的液滴直径明显增大,且视野内液滴数量较少。综合EAI、ESI及微观结构结果,重点讨论F30及其糖基化产物的乳化性质,并选择反应4 h的F30-葡聚糖轭合物进行后续乳液稳定性研究。

图1 SPI、SPIH、F30及反应不同时间的F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的光学显微照片

图2 F30-10及反应不同时间的F30-10-葡聚糖轭合物稳定乳液的光学显微照片

图3 F10及反应不同时间的F10-葡聚糖轭合物稳定乳液的光学显微照片

2.2 乳液粒径和电位分析

SPI、SPIH、F30及反应4 h的F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液平均粒径和ζ-电位如图4所示。观察图4(a)可知,与SPI相比,SPIH稳定的乳液粒径显著降低。这可能是酶水解破坏了蛋白质的肽键,蛋白质结构部分展开,使得内部疏水基团及其他活性氨基酸暴露[20],促进了其在油—水界面的吸附速度和重新定向。与SPIH相比,F30稳定的乳液粒径则有所增加。这可能与F30的表面疏水性进一步增加有关。此外,由F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液平均粒径最小。这可能是多糖的大分子尺寸和亲水性在乳液液滴表面产生了较强的空间位阻效应,增加了液滴周围界面膜的乳化性能和物理稳定性,促进小粒径液滴的形成[21]。

不同样品之间字母不同表示差异显著(P<0.05)

通常来说,当体系的ζ-电位绝对值>30 mV时,被认为足以抑制静电聚集[22]。如图4(b)所示,与SPI相比,SPIH稳定乳液的ζ-电位绝对值有所增加,这与酶水解增加了蛋白质表面可电离基团的数量有关。此外,SPIH经超滤后,所得F30组分的表面电荷数量进一步增加,所以乳液表现出更高的ζ-电位绝对值。然而,F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液却表现出比F30稳定乳液更低的ζ-电位绝对值。这可能是与F30共价结合的葡聚糖覆盖在F30的表面,并且提供使蛋白质电荷远离水相的静电屏蔽效应,减少了带电蛋白质与周围液体之间的静电相互作用,最终降低了轭合物表面的电荷数量[23-24]。因此,由轭合物稳定的乳液表现出相对较低的ζ-电位绝对值。

2.3 乳液贮藏稳定性分析

由于油相与水相之间存在正的自由能,会通过絮凝、沉淀、聚集、Ostwald熟化和重力相分离等各种机制,导致乳液液滴逐渐破裂,稳定性下降[25]。如图5所示,所有乳液液滴的平均粒径总体上均随着贮藏时间延长而逐渐增大。其中,F30样品稳定乳液的粒径增大速度最快,而F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的粒径增大速度则相对较慢。这是由于F30-葡聚糖轭合物吸附层能够提供给乳液液滴更有效的空间位阻稳定作用,从而减缓液滴之间的聚集。此外,在贮藏过程中,乳液的ζ-电位呈波动性变化,说明与静电排斥相比,空间斥力对乳液的贮藏稳定性有更大的影响。这些结果表明,酶解和进一步的糖基化反应可以有效改善乳液在长期贮藏过程中的稳定性。虽然乳液的粒径有所增加,但是所有样品的外观在贮藏期间均保持稳定,未观察到明显的相分离或乳析现象。

不同贮藏时间之间字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4 乳液pH稳定性

由图6可知,随着pH增加,所有乳液的平均粒径呈现出相似的趋势:在pH值为3～5时,乳液体系不稳定,液滴大量聚集,平均粒径超过1 000 nm。相比之下,在pH值为7～9时,乳液相对稳定,液滴分布均匀。此外,所有乳液的ζ-电位绝对值均随着pH的增大而逐渐增加。由于乳化剂的主要成分为SPI或其水解物,所以乳液体系对pH值比较敏感。当pH值接近SPI等电点(pH 4.5)时,乳液液滴之间的静电斥力不够强,无法抵抗疏水性和范德华力的吸引,导致乳化能力下降[25]。因此,虽然葡聚糖可以增强F30的乳化能力,但其物理化学性质仍然受到乳液体系pH值的影响。

不同pH之间字母不同表示差异显著(P<0.05)

如图7所示,从样品外观图中也可以看到,3 g/100 mL SPI稳定的乳液在pH 5时,形成了絮凝体,出现了明显的相分离情况。此外,1 g/100 mL SPI稳定的乳液在pH 5时出现了轻微的分层。而对于SPIH和F30稳定的乳液,在pH值为3和5时出现明显分层现象,上层为白色乳析层,下层为透明乳清层。而且随着浓度的降低,分层现象更加明显。值得注意的是,F30-葡聚糖轭合物所形成的乳液,由于液滴表面高度水合的葡聚糖极大地抑制了轭合物在不同液滴之间的相互作用,从而降低了在pH值为3和5时的分层现象。可见,界面膜的空间斥力和高度水合作用是提高乳状液稳定的必要条件。相反,在pH值为7～9时,所有乳液保持稳定,没有出现分层现象,这也与粒径的结果一致。

图7 pH对不同浓度的SPI、SPIH、F30及F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的外观的影响

2.5 乳液离子强度稳定性

在pH 7时,测量了SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液在不同离子强度(0,50,100,200 mmol/L)下粒径和ζ-电位的变化,如图8所示。当NaCl浓度在0～200 mmol/L范围内增加时,所有乳液的粒径均逐渐增大。并且1 g/100 mL的SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物增加程度最明显。此外,随着NaCl浓度增加,乳液的ζ-电位绝对值均逐渐降低。这种现象可能与盐离子的静电屏蔽作用有关。水相中的反离子(Na+)由于静电吸引,松散地聚集在蛋白质表面的负电荷基团(—COO-)周围,从而屏蔽了它们的净电荷[26]。这促进了乳液液滴之间的聚集和絮凝,增大了液滴尺寸。具体来说,由SPI稳定的乳液表现出最小的粒径变化幅度,且乳液在外观上没有明显变化(如图9所示)。但是,由SPIH稳定的乳液则表现出相对较弱的对抗离子强度稳定性,特别是1 g/100 mL的SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物的乳液放置24 h后出现了分层现象(如图9中虚线位置所示)。而这种现象在F30稳定的乳液中更加明显,乳液分层程度也更大。这可能是因为F30具有较短的肽链和较低的相对分子质量,在油—水界面的吸附层更薄。但是与F30相比,F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的粒径变化幅度明显减小。此外,从外观上未发现分层现象,表明其稳定性优于F30。

不同浓度之间字母不同表示差异显著(P<0.05)

虚线表示乳液分层位置;0,50,100,200对应的NaCl浓度分别为0,50,100,200 mmol/L

2.6 乳液温度稳定性

研究了在30～90 ℃热处理30 min后,SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的粒度和ζ-电位变化,如图10所示。从30 ℃加热至50 ℃时,SPI稳定乳液的粒径均明显降低;而当温度进一步增大至90 ℃时,乳液粒径则逐渐增大。由SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液在30～70 ℃热处理后,粒径增大幅度较小,而在较高的温度70～90 ℃下处理后,粒径明显增加,表明乳液有聚集的趋势。但是F30-葡聚糖轭合物稳定乳液的粒径增加程度相对较低。此外,在热处理过程中,所有乳液的ζ-电位变化不明显,说明热处理未影响乳液液滴之间的静电相互作用,而液滴粒径的增加可能是因为蛋白质吸附层之间通过疏水或二硫键等相互作用聚集所引起的。虽然乳液的粒径在热处理后明显增加,但仍然低于1 000 nm,所以从外观上未观察到分层现象。

不同温度之间字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.7 复溶特性

将SPI、SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液冷冻干燥后,分散在一定量的去离子水中,对其复溶特性进行探究。如图11(a)所示,由SPI和SPIH稳定的乳液在冻干后呈淡黄色,且冻干物质地黏稠,有明显的漏油迹象。而由F30和F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液在冻干后呈白色,粉末干燥,无黏稠或漏油迹象。此外,如图11(b)所示,由SPI稳定的乳液在冻干后,几乎不溶于水,即使在经过外力搅拌后,都很难再恢复至冻干前的状态。这可能与SPI具有较低的溶解度有关。而对于SPIH、F30和F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液,冻干后加水能迅速溶解,形成的乳液分散体系均一、流动性好。但是经过一段时间的放置后,出现轻微的脂肪上浮现象;且该现象在F30稳定的乳液中更为明显。这些结果表明,经过酶水解后,降低了蛋白质分子的相对分子质量,使其结构更加疏松,从而提高了蛋白质的溶解度,这有利于提升乳液冻干后的复溶效果。此外,F30-葡聚糖轭合物较F30表现出更低的脂肪上浮程度,进一步说明了糖基化改性对F30乳化性质的改善作用。同时,良好的复溶效果也将有利于F30-葡聚糖轭合物稳定的乳液作为食品配料在食品体系中的应用。

图11 不同浓度SPI、SPIH、F30及F30-葡聚糖轭合物稳定乳液冻干后的外观形态和复溶效果

3 结论

通过中性蛋白酶水解和葡聚糖糖基化相结合的协同改性对大豆分离蛋白进行改性处理,探究了改性大豆分离蛋白在乳化特性上的变化,评估了改性大豆分离蛋白作为乳化剂稳定乳液的能力。研究结果表明:① 大豆分离蛋白水解物中对乳化性质最有利的主要是相对分子质量较大的组分(F30),相对分子质量较小的组分(F30-10和F10)乳化性质较差。② 酶水解可以提高大豆分离蛋白表面疏水性,促进水解物在油—水界面吸附,乳化活性明显改善;但是在液滴表面形成的界面膜较薄,且水解物之间容易因疏水相互作用发生结构重排,导致乳液在不利环境条件下容易失稳分层。③ 糖基化后,与F30共价结合的葡聚糖可以在液滴表面提供额外的空间位阻作用,增加界面膜厚度,减缓因NaCl的静电屏蔽作用和热处理导致的液滴聚集,提高乳液稳定性。综上,限制性酶解结合糖基化改性是提高大豆蛋白乳化性能的有效手段,后续可继续探讨该研究获得的改性大豆蛋白在稳定新型乳液,如多重乳液、Pickering乳液、多层乳液等方面的潜力。