基因干预MST2的施万细胞稳转株建立及其在线粒体膜电位检测的应用☆

黄贝旭 刘昶 梁嫩 廖松洁

施万细胞是周围神经的胶质细胞，是维持神经正常功能的重要组分，在周围神经损伤修复和神经病理性疼痛过程中起关键性作用。研究表明，施万细胞所形成的完整髓鞘促进轴索再生并抑制神经纤维异位放电[1-2]，创造适合神经修复的微环境，清除含轴索生长抑制物的自身髓鞘，并产生促红细胞生成素等保护性物质和抑制肿瘤坏死因子等，从而可促进痛性周围神经病的恢复[3-4]。并且，施万细胞帮助建立神经轴索与微血管的联系[5]。但是，施万细胞变性、功能异常可激活炎症因子，加剧神经元轴索退化；炎性反应过度的情况下，施万细胞可进一步产生炎性介质和趋化因子，向远端存留或再生的轴索及近端背根神经节感觉神经元渗透，诱导外周敏化[6]。可见，维持施万细胞的正常功能可作为周围神经损伤的治疗靶点，保护施万细胞也是减轻神经病理性疼痛发展和慢性化的重要机制[7-9]。哺乳动物Ste20 样激酶2（mammalian ste20-like kinase 2, MST2）是Hippo 生长抑制通路中关键的丝氨酸/苏氨酸激酶之一，在调控细胞凋亡、增殖和分化中起重要作用[10]。本课题组以往研究发现，敲低MST2的同源类似物可改善神经损伤诱导的神经病理性疼痛，并且逆转施万细胞的线粒体功能障碍[11]，但是调控的具体机制尚不清楚。为了开展进一步的机制研究，本实验拟构建工具细胞，即使用第二代慢病毒包装系统，构建稳定敲低及过表达MST2的大鼠施万细胞系，检测基因干预MST2的效率及对于线粒体膜电位的影响，为研究MST2 在施万细胞的调控作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 稳转株的构建采用大鼠施万细胞株（RSC96），慢病毒包装采用人胚肾细胞株（HEK293 T），均来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。敲低Mst2基因的慢病毒重组质粒、第二代慢病毒系统包装质粒pSPAX2和pMD2.G、感受态大肠杆菌（货号：TSC-C06）、Polybrene 及相关引物购自北京擎科生物科技股份有限公司。过表达慢病毒载体GV341 及相应慢病毒包装质粒pHelper 1.0 和pHelper 2.0、吉凯转染试剂由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。限制性核酸内切酶AgeI/NheI（货号：R3552S；R3131V）来源于New England Biolabs公司。反转录试剂盒（货号：A233）、超保真PCR 预混液（货号：A064）、无缝克隆试剂盒（货号：T196）及胶回收试剂盒（货号：D205）均购自北京康润诚业生物科技有限公司。重组质粒测序由广州易锦生物技术有限公司完成。

1.2 实验分组 本实验细胞株分为6 组：对照（control，CON）组，即正常对照组；氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation，OGD）组，即氧糖剥夺模型组；sh-NC 组，即MST2 敲低对照组；sh-MST2 组，即MST2 敲低组；p-NC 组，即MST2 过表达对照组；p-MST2 组，即MST2 过表达组。每组实验重复4～6次。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 根据NCBI 基因数据库上大鼠Mst2基因全长序列（NM_031735），以及GV341载体多克隆酶切位点AgeI/NheI进行引物设计：Primer F，5'CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGAGC AGCCGCCGGCGCC 3'，Primer R，5' AATGCCAACT CTGAGCTTGAAATTCTGCTGCCTCCTCTTTTTG 3'。引物包含无缝克隆交换配对碱基位点、酶切位点，并包含目的基因5'端部分序列用于与目的模板配对。

1.3.2 逆转录PCR 扩增大鼠施万细胞Mst2全基因序列 使用TRIzol 法提取施万细胞总mRNA，并取1 μg 反转录为cDNA。以cDNA 为模板，使用上述引物进行大鼠Mst2全长序列扩增（PCR 仪，德国Biometra公司）。PCR扩增条件：98 ℃预变性3 min，98 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，35 个循环反应，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将反应产物进行DNA 聚丙烯酰胺凝胶电泳，对相应片段进行凝胶回收，即获得含有无缝克隆碱基位点、AgeI/NheI 酶切位点和Mst2全基因序列的DNA产物。

1.3.3 大鼠施万细胞过表达Mst2重组质粒构建及鉴定 使用限制性核酸内切酶AgeI/NheI 酶进行GV341 载体线性化，以Mst2DNA 产物∶线性化载体摩尔比为3∶1 的比例配制无缝克隆反应体系，混匀后于PCR 仪中50 ℃反应15 min，反应结束后置于冰上，即可获得Mst2过表达重组质粒。将重组质粒转化感受态大肠杆菌，进行原核抗生素筛选，挑取单克隆菌落摇菌扩增，提取质粒后进行PCR 鉴定，鉴定引物为Primer F，5' TGGACTACTTTGATAAGC AG 3'，Primer R，5' CCTTATAGTCCTTATCATCGT C 3'，将产物进行DNA 凝胶电泳，并挑选阳性转化子的重组质粒送测序。

1.3.4 慢病毒包装及获取 慢病毒包装细胞HEK293T 均匀种于含有10% FBS DMEM 双抗培养基细胞培养皿。敲低Mst2基因的慢病毒重组质粒是由特异性敲低Mst2的短发夹RNA（short hairpin RNA, sh-RNA）与慢病毒载体pLKO.1-PURO 重组合成，序列为5' GCAAGTACCTGTTGAGTCA 3'。敲低MST2 慢病毒生成转染体系，即按目标质粒∶pSPAX∶pMD2.G为4∶3∶1的比例在无血清培养基中与3 倍于质粒总质量的聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）混合，室温静置20 min 后转染HEK293T细胞。过表达MST2 慢病毒生成转染体系，即按目标质粒∶pHelper 1.0∶pHelper 2.0 为4∶3∶2 的比例与吉凯转染试剂混匀，室温孵育15 min后缓慢滴加至HEK293T 细胞培养基中。分别于48 h、72 h、96 h收取病毒上清液，同时更换新鲜培养基，并将收取后的上清液置于4 ℃冰箱保存。使用0.45 μm 滤器过滤收集的上清液，并加入5×慢病毒浓缩液4 ℃过夜，次日超速离心浓缩病毒，使用无菌PBS 稀释病毒沉淀后分装为每管50 μL，-80 ℃保存。根据以上步骤可获取敲低及过表达MST2的慢病毒毒液。

1.3.5 敲低及过表达MST2 的施万细胞稳转株的建立 大鼠施万细胞培养于10% FBS DMEM 双抗完全培养基，待细胞生长至60%～70%密度时将培养基更换为含有敲低或过表达MST2慢病毒毒液的完全培养基，并使用相应空载慢病毒毒液作为对照，同时加入Polybrene 增加病毒感染效率，使其终浓度为8 mg/L，轻轻摇匀后置于37 ℃、5% CO2的孵箱中过夜培养。次日更换为普通完全培养基，待细胞密度生长至80%～90%时，按（1∶2）～（1∶3）传代。将慢病毒感染后48～72 h 的细胞培养于含有2.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基中，筛选3～5 d后，未感染慢病毒组细胞全部死亡，即可认为感染病毒组剩下的全是稳转株细胞，并将其标记为第一代基因干预的施万细胞稳转株，进一步进行MST2 的敲低及过表达鉴定。

1.3.6 实时荧光定量PCR 检测Mst2基因 使用TRIzol 法提取细胞总mRNA，并取1 μg 进行反转录反应，以SYBR GREEN（货号：K21203，Abclonal）作为染料按说明书配制qPCR 反应体系，于实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）中进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR），反应条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，进行40 个循环反应，最后测定解链曲线。所用引物序列为Mst2Primer F，5' AGGAACAGCAACGAGA ATTGG 3'，Mst2Primer R，5' CCCCTTCACTCATCG TGCTT 3'；β-actinPrimer F，5' ATTGCTGACAGGA TGCAGAA 3'，β-actinPrimer R，5' TAGAGCCACC AATCCACACAG 3'。以β-actin作为内参，使用2-△△Ct法计算结果并进行统计分析。

1.3.7 蛋白印记（western blot，WB）检测MST2 使用RIPA 蛋白裂解液（货号：89900，美国Thermo Fisher Scientific 公司）提取细胞蛋白，测定蛋白浓度后加入loading buffer 置于100 ℃水浴10 min 使蛋白充分变性。取20 μg 蛋白进行凝胶电泳，并进行充分转膜，结束后使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h后加入相应一抗4 ℃孵育过夜（MST2, 1∶10000；β-actin,1∶20000）。次日使用含有吐温20 的Tris 缓冲盐溶液洗涤3 次，每次10 min，加入HRP 偶联的二抗（1:3000），室温孵育1 h，充分洗膜后于化学发光成像分析系统（美国GE 公司）曝光。使用Image J 软件（美国）按照条带灰度值进行定量分析。

1.3.8 OGD模型的建立 使用PBS润洗细胞2次，并将培养基更换为无糖培养基。将培养皿放于提前紫外消毒过夜的无氧罐中，并在罐中置入1 颗氧气指示剂及钯粒。抽走其中的气体，并充入90% N2、5% CO2和5% H2的混合气体，重复循环3 次。使用75%乙醇溶液消毒无氧罐后放入培养箱中孵育5～6 h，结束后即可进行下一步实验。

1.3.9 线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential， MMP）检测 使用检测试剂盒（JC-1，货号：C2006，上海碧云天生物技术股份有限公司）检测细胞MMP。MMP 较高时，JC-1 形成聚合物发出红色荧光；反之，JC-1 为单体发出绿色荧光。按照说明书提前配制1×JC-1 染色缓冲液及1×JC-1 染色工作液。将细胞接种于培养皿或细胞爬片并按实验分组对细胞进行OGD处理后，使用PBS清洗细胞2次，加入适量1×JC-1染色工作液37 ℃避光孵育20 min，结束后使用1×JC-1染色缓冲液洗涤2次，并加入适量的完全培养基，置于荧光显微镜下观察并拍照。每组细胞取9个视野（200×），使用Image J软件分析每张照片平均荧光强度，取平均值，聚合物荧光强度/单体荧光强度即为MMP，比值降低提示异常。

1.4 统计学方法 使用GraphPad Prism 9.0 对数据进行统计分析，结果采用平均值±标准误描述。两组之间各结果比较用两独立样本t检验；多组间各结果比较用单因素方差分析，采用Turkey's 检验进行两两比较。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 过表达Mst2的慢病毒表达载体构建及鉴定本研究利用特异性引物扩增出了大小约1500 bp的目的基因条带，与预期的大鼠Mst2基因全长序列片段大小一致（图1 A）。将该基因条带切胶回收并连接至GV341 载体中，构建重组质粒。通过PCR 法对重组质粒进行鉴定，并进行DNA 凝胶电泳，结果显示Mst2基因的特异性引物可产生约370 bp 的产物（图1 B）。将阳性转化子的重组质粒进行测序，测序结果与预期的Mst2基因序列完全相同。

Fig.1 Construction and identification of lentiviral expression vector overexpressing Mst2图1 过表达Mst2 的慢病毒表达载体构建及鉴定 A. DNA 凝胶电泳获取大鼠Mst2基因全长序列片段，约1500 bp。B. PCR 法结合凝胶电泳鉴定重组质粒，可见约370 bp的Mst2特异性基因片段。

2.2 稳转细胞株具备施万细胞的特征 培养施万细胞并构建MST2敲低和过表达稳转株。通过光镜观察施万细胞稳转株，可见细胞生长形态为神经元样长梭形，贴壁生长，细胞大小及形态与未干预的施万细胞相同。S100 作为施万细胞的特异性标记蛋白，是细胞鉴定的可靠指标。MST2 敲低及过表达稳转株可于胞质内正常表达S100，表明稳转株未受到其他细胞株污染，并保持施万细胞的特征（图2）。

Fig.2 Knockdown and overexpression of MST2 do not alter Schwann cell morphology图2 敲低及过表达MST2 不改变施万细胞形态 光镜：Brightfield，200×；绿色荧光：S100，200×。标尺=100 μm，n=4/组。CON，正常对照组；sh-MST2，MST2敲低组；p-MST2，MST2过表达组。

2.3 成功构建敲低及过表达MST2 的施万细胞稳转株 qRT-PCR 结果表明，相对于敲低及过表达各自病毒的对照，MST2 成功被敲低及过表达（P＜0.0001），敲低效率为对照的90%以上，过表达为其对照的大约40 倍（图3 A）。进一步进行WB 检测，与qRT-PCR 结果一致，MST2 均成功被敲低及过表达（P＜0.0001）（图3 C、E）。将细胞继续培养5 代，使用qRT-PCR及WB方法检测基因干预的稳定性。结果显示，相对于对照组，施万细胞敲低及过表达MST2 的效果仍然显著（P＜0.0001）（图3 B、D、F）。以上结果表明成功构建了敲低及过表达MST2的施万细胞稳转株。

Fig.3 Rat Schwann cell lines that stably knock down and overexpress MST2 were successfully constructed图3 成功构建敲低及过表达MST2的施万细胞稳转株 A～B. qRT-PCR 技术分别检测第一代及第五代施万细胞稳转株Mst2 mRNA 表达水平。C～D. WB技术分别检测第一代及第五代施万细胞稳转株MST2蛋白水平，β-actin作为参照。E～F. 第一代及第五代施万细胞稳转株MST2蛋白表达水平灰度值量化分析结果。****P＜0.0001，每组n=4。sh-NC，MST2 敲低对照组；sh-MST2，MST2 敲低组；p-NC，MST2 过表达对照组；p-MST2，MST2过表达组。

2.4 施万细胞稳转株在OGD 模型中稳定表达MST2 培养的施万细胞经OGD处理6 h后，通过光镜观察其形态学变化，可见OGD 组施万细胞突触消失，细胞由双极样转变为圆形，同时胞质内颗粒度增加，表明OGD 可损伤施万细胞（图4 A）。WB检测发现，OGD 组MST2 蛋白水平增高（P＜0.05）。在Mst2基因敲低的施万细胞稳转株，MST2 蛋白水平显著下降（P＜0.001）；而在基因过表达稳转株，MST2 蛋白水平显著上调（P＜0.001）（图4 B），表明该稳转株可稳定应用于OGD病理模型。

Fig.4 The MST2 level of the stably transfected Schwann cell lines in OGD model图4 施万细胞稳转株在OGD 模型中的MST2 蛋白水平 A. OGD处理施万细胞后形态学改变。光镜：Bright-field，200×。B. WB 技术检测OGD 处理6 h 后施万细胞稳转株的MST2 蛋白表达水平，β-actin 作为参照。C. MST2 表达水平灰度值量化分析结果，*P＜0.05，***P＜0.001，每组n=4。CON，正常对照组；OGD，氧糖剥夺模型组；sh-NC，MST2 敲低对照组；sh-MST2，MST2 敲低组；p-NC，MST2过表达对照组；p-MST2，MST2过表达组。

2.5 OGD 模型中MST2 参与线粒体膜电位的调控使用JC-1探针装载施万细胞，以检测MMP，在荧光显微镜下拍照分析。结果显示，OGD导致红绿荧光比值明显下降，证实MMP 受损（P＜0.001）；而MST2敲低后，红绿荧光比值显著回升，提示逆转了OGD导致的MMP 损伤（P＜0.001）。但是，与p-NC 对照组相比，过表达MST2对已受损MMP 的影响并无统计学意义（P＞0.05）（图5）。上述结果表明，MST2参与施万细胞线粒体膜电位的调控，敲低MST2 可以起保护作用。

Fig.5 MST2 participates in the regulation of mitochondrial membrane potential图5 MST2 参与线粒体膜电位的调控 A. 使用JC-1 探针标记线粒体膜电位。红色荧光，多聚体（J-aggregates），200×；绿色荧光为单体（Jmonomers），200×。标尺=100 μm。B. 红绿平均荧光强度比值量化分析结果，*** P＜0.001，nsP＞0.05，每组n=6。CON，正常对照组；OGD，氧糖剥夺模型组；sh-NC，MST2敲低对照组；sh-MST2，MST2敲低组；p-NC，MST2过表达对照组；p-MST2，MST2过表达组。

3 讨论

本研究构建重组质粒，并使用第二代慢病毒包装系统成功构建稳定敲低及过表达MST2的大鼠施万细胞株；将该细胞株应用在OGD 模型中，敲低MST2 可改善线粒体膜电位，提示其对线粒体具有保护作用。

对比其他研究应用的小干扰RNA 敲低或普通质粒载体过表达目的基因的方法，慢病毒能将外源基因整合至宿主细胞，从而在细胞中稳定长期表达，且不会产生化学转染引起的细胞损伤。同时，在过表达基因中加入标签序列，可使用高浓度且价格优惠的标签抗体进行实验，提高检测的阳性率[12-15]。目前，慢病毒实验系统已广泛用于分子实验的研究中。由于感染慢病毒的细胞在未使用相应抗生素时，有逐渐被正常细胞取代而丢失基因干预效果的可能性，故本研究采用了合适浓度的嘌呤霉素维持筛选流程，并在感染慢病毒第一代及第五代的施万细胞中，从mRNA 及蛋白水平双重验证了基因干预MST2 的稳定性。值得注意的是，WB 技术检测过表达MST2 的稳转株可见MST2 双条带，这与添加了蛋白标签的外源性MST2 有关。S100在神经系统中主要表达于施万细胞，可作为细胞鉴定的特异性指标[16]。本研究通过S100 免疫荧光证明了MST2敲低及过表达稳转株仍保持施万细胞的特征。

在成功构建稳转株的基础上，本研究对施万细胞进行OGD 处理。OGD 是研究线粒体稳态方向较为理想的细胞模型，可模拟体内因缺血缺氧引起的神经损伤。多种神经系统疾病研究以OGD 作为细胞模型可一定程度上模拟体内环境，如脑血管疾病、神经压迫性损伤等[11,17]。本研究结果证实，OGD可以损伤施万细胞。在OGD 处理的施万细胞稳转株，基因敲低组MST2蛋白水平显著下降，而基因过表达组MST2 蛋白水平显著上调，表明基因干预MST2的效果仍然稳固。

利用施万细胞稳转株这一工具细胞建立OGD模型，本研究进一步进行线粒体功能指标检测，初步探讨MST2对于线粒体的作用。线粒体是细胞能量来源的核心，参与细胞代谢、钙离子稳态、细胞凋亡调控及脂质合成等过程[18]。正常的MMP 是线粒体氧化磷酸化稳态的重要前提，MMP 的丢失可导致电子从线粒体呼吸链外溢，引起活性氧大量生成[19]。因此，MMP是反映线粒体功能的可靠指标之一[19]。既往关于MST2 在线粒体功能上的研究结论尚不一致，与细胞类型不同有关。在脂肪细胞中，MST2 可过度激活线粒体自噬，导致线粒体丢失和功能障碍[20]；但在巨噬细胞中，MST2 可募集至受损线粒体，增加细胞内抗氧化蛋白的稳定性而减轻细胞内过度的氧化应激反应[21]。在本研究的施万细胞中，MST2 参与MMP 的调控，敲低MST2 可以改善OGD 诱导的MMP损伤，提示具有保护线粒体作用。但在过表达MST2 的施万细胞中，MMP 没有明显改变，推测OGD条件下MMP已明显受损，进一步上调MST2 并不能带来显著改变；此外，在OGD 条件下，MST2的功能可能已经达到饱和状态，上调MST2并不能增加其发挥功能的效果。以往研究表明，MST2 在自噬及线粒体自噬中发挥重要作用[10,20,22-24]。本课题组既往研究也发现，敲低MST2同源类似物可改善线粒体自噬、减少氧化应激，并保护线粒体功能[11]。故推测MST2 调控施万细胞MMP 的作用可能与自噬或线粒体自噬有关，这仍需进一步实验验证。

综上，本研究成功构建稳定敲低及过表达MST2 的大鼠施万细胞株，并对其在调控线粒体膜电位方面进行了初步研究。未来研究将利用成功构建的细胞株进一步探究MST2在线粒体功能及神经病理性疼痛等疾病模型中的作用。