角膜淋巴管生成的内源性调控因素及新生淋巴管相关眼表疾病研究进展△

张子然 李柯然

生理状态下,角膜在促血管及淋巴管生成和抗血管及淋巴管生成之间保持动态平衡,从而维持角膜的透明性[1]。角膜血管的缺失一定程度上限制了免疫效应细胞进入角膜组织,角膜淋巴管的缺失使抗原物质难以进入引流区的淋巴结,引起免疫耐受。角膜对移植物或其他抗原刺激产生的无免疫应答状态,称为角膜的“免疫赦免”。然而,在角膜感染、碱烧伤、干眼症、角膜移植等病理状态下,平衡状态被打破,血管和淋巴管由角膜缘向角膜中央延伸[2]。角膜血管和淋巴管的生成不仅严重损害视功能,更打破了角膜的“免疫赦免”状态。随着LYVE-1等淋巴内皮特异性标志物的发现[3],越来越多的课题开始聚焦于角膜淋巴管生成的研究,但是目前临床上仍然缺少特异性调节淋巴管生成的治疗策略。本文综述了角膜淋巴管生成的内源性调控因素及新生淋巴管相关眼表疾病的治疗策略。

1 角膜淋巴管生成的内源性调控因素

1.1 调节因子

在众多与淋巴管生成有关的内源性调节因子中,血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang)等可直接作用于淋巴管内皮细胞(LECs),调控淋巴管生成,而成纤维细胞生长因子(FGF)和炎症细胞因子等可通过调节VEGF的表达发挥间接调控作用。

1.1.1 VEGF

VEGF是调节角膜新生淋巴管形成的关键细胞因子。当VEGF受体(VEGFR)与VEGF结合后,激酶区构象发生改变产生激酶活性,进而催化底物蛋白磷酸化,最终通过信号转导分子的级联反应发挥一系列生物效应。其中,成人的血管内皮细胞主要表达VEGFR-1和VEGFR-2,而LECs主要表达VEGFR-3[4]。

VEGF-A激活VEGFR-2可促进LECs增殖。Björndahl等[5]通过建立小鼠角膜淋巴管生成模型发现,VEGFR-3拮抗剂无法成功抑制VEGF-A所诱导的淋巴管生成,证明VEGF-A以独立于VEGF-C/-D/R-3信号轴的方式促进淋巴管生成。而后,Dellinger等[6]证明VEGF-A激活VEGFR-2,通过PI3-K和ERK1/2信号通路直接驱动LECs增殖和迁移,揭示了VEGF-A促进淋巴管生成的潜在机制。

VEGF-C和VEGF-D结合并激活VEGFR-2和VEGFR-3,使其形成同源二聚体并促进细胞质酪氨酸残基的自磷酸化,从而激活Akt和ERK等下游信号通路,诱导淋巴管生成[7]。现已在小鼠模型中证明,使用单克隆抗体或可溶性VEGFR(VEGFC/D traps)能够阻断VEGF-C、VEGF-D与LECs膜表面VEGFR的有效结合,从而降低淋巴管的密度和出芽能力[8-9]。最近,Le等[10]研究发现,全身应用VEGF TrapR1R2几乎能够完全抑制角膜缝线小鼠模型中的血管和淋巴管生成。随后该团队进一步研究显示,在角膜移植术后局部应用VEGF TrapR1R2滴眼液可以抑制角膜淋巴管生成[11-12]。

1.1.2 Ang

除了VEGF/VEGFR途径外,Ang/Tie系统是淋巴管生成所必需的另一种内皮细胞特异性配体-受体信号系统。Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4,且均作用于其特异性受体Tie-2[13-14]。

Ang-1是Tie-2的强激动剂,可以诱导内皮细胞迁移、出芽和成管。而Ang-2是Tie-2的弱激动剂或拮抗剂,可以抑制Ang-1/Tie-2信号转导通路[15]。Gale等[16]在小鼠模型中发现,Ang-1可以挽救Ang-2突变小鼠的淋巴管生成障碍,证明Ang-1在淋巴管生成中发挥调节作用。

Toyono等[17]发现,在缝线诱导的角膜新生淋巴管模型中,Ang-2在角膜组织中表达显著升高,其对于诱导炎性角膜新生淋巴管至关重要。此外,研究发现,Ang-2不仅能够调控淋巴管生成,还参与调节LECs间连接的转换并维持连接的完整性[18]。Zhang等[19]通过拮抗Ang-2减少了淋巴管介导的供体细胞向引流淋巴结的运输,最终提高了角膜移植物的存活率,这进一步证明Ang-2的重要作用。

1.1.3 FGF

FGF 家族至少包含22种不同亚型,其特异性细胞表面受体(FGFR)是具有酪氨酸激酶活性的单程跨膜蛋白[20]。特别的是,FGF与FGFR的相互作用需要肝素或硫酸肝素蛋白聚糖的干预以稳定其受体二聚体的形成。因此,FGF的活性在多个水平上受到调节,包括生长因子表达、受体结合亲和力和与硫酸肝素蛋白聚糖的相互作用等[21]。

研究发现,FGF-2通过激活FGFR-1介导的信号通路直接作用于LECs,促进其增殖和迁移。此外,FGF-2和VEGF-C在体内协同刺激淋巴管生成的过程中,利用中和抗体阻断VEGFR-3,能够显著抑制FGF-2诱导的淋巴管生成,这表明FGF-2通过VEGF-C/VEGFR-3信号系统间接调控淋巴管生成[22]。Xie等[23]研究发现,Notch信号通路参与碱性FGF诱导的角膜淋巴管生成,Notch通路的抑制上调了VEFG-A的表达,从而促进碱性FGF诱导淋巴管生成。

除了诱导淋巴管生成,FGF-2还可调控某些细胞因子的表达。Gurung等[24]在单纯疱疹病毒性角膜炎的研究中发现,阻断FGF-2抑制了病毒感染小鼠角膜淋巴管的生成,降低了包括肝细胞生长因子、白细胞介素(IL)-6和VEGF-A在内的血管生成因子的表达,提示FGF-2有望成为抑制病理性淋巴管生成的潜在治疗靶点。

1.1.4 炎症细胞因子

炎症反应在淋巴管生成和重塑过程中发挥重要作用[25],许多促炎细胞因子,例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL、血小板源性生长因子等已被证明可促进血管和淋巴管生成。

角膜炎症状态下,TNF-α在角膜上皮、基质和内皮中表达均升高[26]。Zhang等[27]研究发现,TNF-α可通过NF-κB诱导巨噬细胞产生VEGF-C,刺激淋巴管生成。此外,在小鼠眼表瘢痕模型中,抑制TNF-α可显著减少角膜新生淋巴管的生成[28]。

IL-8以非依赖于VEGF的形式直接促进LECs的增殖、迁移和小管形成,诱导角膜淋巴管生成[29]。最近,Han等[30]的研究结果首次表明IL-33通过ST2/TRAF6介导的Akt/eNOS/NO信号通路促进炎症诱导的淋巴管生成,为治疗炎症和淋巴管生成相关疾病提供了更多的可能。

P物质存在于角膜神经丛、泪液、角膜上皮细胞和角膜基质细胞中。作为神经系统与免疫系统间通信的关键分子,P物质通过神经激肽-1受体发挥其炎症和免疫活性。P物质/神经激肽-1受体系统能够调控VEGFR-3的表达,直接促进角膜病理性淋巴管生成[31]。

1.2 免疫细胞

1.2.1 巨噬细胞

巨噬细胞是一类具有吞噬、抗原递呈以及分泌炎症细胞因子能力的免疫细胞,存在于虹膜、睫状体、结膜和角膜等眼部组织中,并在调节角膜血管和淋巴管生成的过程中发挥重要作用。巨噬细胞调节淋巴管生成主要通过以下几种机制[32-34]:(1)通过分泌VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D等旁分泌因子促进淋巴管生成;(2)巨噬细胞表达的VEGFR-1和VEGFR-3介导炎症细胞的趋化作用,维持炎症反应和淋巴管生成;(3)巨噬细胞可能在发芽的淋巴管尖端作为桥梁细胞发挥作用,以非依赖血管生长因子的方式引导末端细胞与其他发芽淋巴管的尖端细胞吻合;(4)巨噬细胞通过转分化为内皮细胞,在结构上参与构成并直接促进新生淋巴管的形成。

最近,IL-10激活的巨噬细胞在炎性角膜淋巴管生成中的重要作用已被证实[34]。IL-10在健康角膜中不表达,而在被炎症浸润的巨噬细胞中高表达,并通过巨噬细胞调控角膜淋巴管的生成和角膜炎症的消退。实验证明,IL-10刺激巨噬细胞可发挥抗炎作用并且诱导其VEGF-C表达上调,从而诱导角膜淋巴管的生成和局部炎症反应的终止[35]。

1.2.2 肥大细胞

肥大细胞也被称为前哨免疫细胞,被激活后可释放多种细胞因子、酶和血管活性胺等,诱导更多的免疫细胞对病原体或组织损伤做出反应[36]。肥大细胞在皮肤和眼表等与外部环境交界的血管化组织中表达最为丰富。眼表肥大细胞仅存在于角膜缘区域,在炎症损伤后向中央角膜浸润[37]。Cho等[38]先前证明肥大细胞通过分泌高水平的VEGF-A调节血管内皮细胞功能,促进角膜血管生成。最近,该团队进一步探究了肥大细胞与LECs的相互作用。体外实验表明,肥大细胞高表达VEGF-D并直接促进LECs成管和增殖。此外,通过清除小鼠的肥大细胞以及局部应用色甘酸钠抑制肥大细胞功能,可阻断角膜组织损伤后病理性淋巴管的生成[39]。这些发现为眼表肥大细胞作为调节病理性淋巴管生成的潜在治疗靶点提供了新的方向。

2 角膜新生淋巴管相关眼表疾病的治疗

角膜新生淋巴管与各种临床疾病密切相关,包括同种异体移植排斥反应、干眼症和角膜炎症等,深入了解眼部淋巴管生成机制并以此开展针对性治疗对预防疾病发生及改善预后具有重大意义。

2.1 角膜移植排斥反应

由于角膜无淋巴管及血管,角膜异体移植的排斥率低于其他组织[40],而淋巴管的出现有利于抗原递呈至区域淋巴结并加速致敏。研究发现,将供体角膜移植到含有血管但不含淋巴管的角膜比移植到二者皆存在的角膜成功率更高,说明淋巴管的存在提示移植失败处于高风险状态,在移植前选择性抑制淋巴管生成是提高移植成功率的可行治疗策略[41]。

近年来,抗VEGF治疗已被证明在抑制角膜移植排斥反应中具有一定作用。局部或结膜下使用贝伐珠单抗中和VEGF-A可显著降低角膜混浊度,提高移植物存活率。可溶性VEGFR-3通过阻断VEGF-C/VEGFR-3信号转导抑制淋巴管生成,减少移植排斥反应[42]。此外,鬼臼素已被证明是淋巴管内皮的特异性标志物[43],Maruyama等[44]研究发现,使用鬼臼素抗体能抑制淋巴管生成,具有提高移植物存活率的作用。细针透热是目前临床治疗成熟病理性角膜血管的一种方法。近期Le等[45]证明细针透热联合抗炎治疗能够促使角膜淋巴管消退,显著提高角膜移植术后移植物的存活率。Hou等[46]使用角膜缝线小鼠模型研究发现,使用核黄素和紫外线进行的角膜胶原交联术可以通过诱导血管内皮细胞和LECs凋亡使已成熟的角膜血管和淋巴管消退,提高高风险小鼠角膜移植术的成功率。

2.2 干眼症

干眼症是一类多因素眼表疾病的统称,其病理过程复杂。各种眼表上皮病变、免疫性炎症、性激素水平降低以及外界环境等因素均可能导致泪膜稳定性下降,引起眼部不适及眼表组织损害[47]。目前,干眼症已被证实与免疫系统的激活密切相关,由于干眼症患者角膜淋巴管生成并不伴随血管生成,因而新生淋巴管在介导区域淋巴结的免疫应答激活和免疫细胞迁移中发挥核心作用,成为干眼症发病机制的关键环节。Ji等[48]使用干眼症小鼠模型证实,抑制淋巴管生成可减轻炎症反应并保护角膜神经,提示靶向淋巴管生成可作为干眼症的潜在治疗策略。目前,已有几项临床研究评估了抗淋巴管生成疗法在干眼症治疗中的应用,Kasetsuwan等[49]在一项前瞻性随机双盲试验中评估了贝伐珠单抗滴眼液在干眼症患者中的有效性和安全性,结果显示接受贝伐珠单抗滴眼液治疗的患者在泪膜稳定性、角膜染色评分和临床症状方面均表现出显著改善。

2.3 单纯疱疹病毒性角膜炎

单纯疱疹病毒是一种DNA病毒,由单纯疱疹病毒引起的角膜感染称为单纯疱疹病毒性角膜炎。单纯疱疹病毒分为两种血清型,其中眼部感染的多为单纯疱疹病毒-1型,感染后诱发的新生淋巴管在感染消退后持续存在,打破角膜的“免疫赦免”状态[50]。该病易反复发作,最终因角膜混浊而导致失明[51]。胰岛素受体底物-1被认为与单纯疱疹病毒感染的淋巴管生成有关,GS-101是一种抑制胰岛素受体底物-1的反义寡核苷酸,可抑制角膜淋巴管生成[52]。与其他炎性淋巴管生成机制不同,单纯疱疹病毒-1诱发的淋巴管生成不依赖于巨噬细胞募集或VEGF-C/D的表达,而是严格依赖于VEGF-A/VEGFR-2信号转导[53]。因此,基于此病理机制,使用VEGF-A抑制剂或利用可溶性VEGFR-2阻断信号转导是单纯疱疹病毒性角膜炎的潜在治疗策略,有望在疾病的早期阶段选择性抑制角膜淋巴管的生成[54]。

3 结束语

随着研究的逐步深入,越来越多的调节因子被证实具有调控角膜淋巴管生成的作用,然而对于眼表疾病中淋巴管调控网络的认识仍处于初步探索阶段,调节因子如何调控角膜淋巴管生成及其因子之间的相互作用仍有待进一步明确。同时,针对角膜病理性淋巴管治疗策略的安全性及有效性研究尚不充分。本文综述了当前角膜淋巴管生成的内源性调控因素的研究进展,并结合新生淋巴管相关眼表疾病的治疗策略进行探讨,以期为角膜新生淋巴管的未来研究提供可靠的理论依据和研究方向。