mTOR在非酒精性脂肪性肝病脂质代谢中的作用研究进展

邱晓远 胡德胜 杨梦灵 朱 锐

华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科,武汉 430022

随着经济的发展和生活方式的转变,非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为全球最普遍的肝脏疾病,是肝细胞癌的主要危险因素,也与2型糖尿病、心血管疾病等的风险增加有关。NAFLD是指在很少饮酒或不饮酒且没有肝脏脂肪变性继发原因(如病毒性肝炎、脂肪营养不良或已知会诱发这种疾病的药物暴露)的个体中,继发于肝脏脂肪过度积累的一系列疾病[1],常作为肥胖的并发症,与2型糖尿病、血脂异常和高血压等密切相关,是常见的肝脏脂质代谢异常诱发的代谢类疾病。NAFLD是一个连续的疾病谱,大致可以分为2个亚型:伴或不伴轻度炎症的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty live,NAFL)以及伴有坏死性炎症的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH),其特征是明显的肝脂肪变性、肝小叶炎症以及肝细胞肿胀。随着肝细胞损伤和肝脏炎症的进一步加重,NAFL发展为NASH,继续加重的肝损伤和纤维化的积累会导致肝硬化和肝癌,危及生命。随着经济水平的增长和居民生活方式的改变,近十年内,中国NAFLD患病率的增长速度是西方国家的两倍[2]。NAFLD发病机制复杂,临床治疗手段乏善可陈,早期可以通过改变生活方式、减轻体重得到恢复,但是疾病进展到纤维化后就很难逆转,一旦发展到肝硬化和肝癌,只能依靠肝脏移植。因此,揭示NAFLD发病机制,寻找潜在的干预靶标,将更好地指导有效药物的开发和临床决策。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路处于细胞生长和代谢的中心,参与许多代谢性疾病的发生;大量研究表明,抑制mTOR对缓解NAFLD有益。mTOR关联许多信号通路,它通过调节细胞内的能量和营养状态来协调细胞成分的合成与分解,是调控细胞生长的网络中心节点。研究证实,NAFLD的发生发展与mTOR通路介导的脂代谢异常密切相关。基于此,本文聚焦于目前国内外对mTOR通路调控脂代谢的研究,综述其在NAFLD中的作用。

1 mTOR结构与功能

mTOR是胞内磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol-3 kinase-related kinase,PIKK)家族的一个289k Da的丝/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物中,mTOR核化形成2个功能和结构不同的复合物,即mTOR复合体1(mTOR complex 1,mTORC1)和mTOR复合体2(mTOR complex 2,mTORC2),二者的组成、对雷帕霉素的敏感性、底物以及功能都不尽相同。相较而言,mTORC2功能更简单,而mTORC1通过磷酸化下游底物,可以调控多个生物过程。mTORC1核心成分为mTOR、哺乳动物致死蛋白8(mammalian lethal with SEC13 protein 8,mLST8)和mTOR相关调节蛋白(regulatory-associated protein of mTOR,RAPTOR),其中,mLST8稳定mTOR的激酶结构域,RAPTOR负责mTORC1的亚细胞定位和招募底物。mTORC1通过小GTP酶RagA、RagB、RagC和RagD感知营养可用性,整合营养物质、生长因子和能量输入,促进合成代谢和细胞生长,同时抑制分解代谢。Rags形成异源二聚体,其活性构象RagA/RagBGTP和RagC/RagDGDP将mTORC1招募到溶酶体中,并被小GTP酶Ras蛋白脑组织同源类似物(Ras homolog enriched in brain,Rheb)激活。激活后的mTORC1磷酸化下游底物增加蛋白合成等合成代谢途径,抑制自噬、溶酶体生物合成等分解代谢相关通路;其中,真核翻译起始因子-4E结合蛋白-1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1,eIF4E-BP1)和核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)是经典的mTORC1底物,其磷酸化后促进蛋白合成。

2 mTOR信号通路在NAFLD中的作用

虽然一般认为肥胖与NAFLD密切相关,但体重正常的非肥胖人群也会出现NAFLD,其危险因素是高尔基体蛋白73;通过其GTP酶激活蛋白活性调节极低密度脂蛋白-载脂蛋白B从肝内向肝外的输出,使肝脏中的甘油三酯、胆固醇等脂类向肝外运输受阻,进而促使了非肥胖型NAFLD的形成[3]。有趣的是,低蛋白饮食的营养不良人群也会罹患严重肝脂肪变性,在必需氨基酸,尤其是支链氨基酸、亮氨酸和异亮氨酸缺乏时,肝细胞中的E3泛素连接酶Ubr1失活,其催化降解具有稳定脂滴作用的Plin2蛋白的作用被抑制,Plin2蛋白水平的升高抑制了肝脏脂质的分解,从而引起肝脏脂肪变性[4]。由此可见,NAFLD最主要的表现是肝脏脂质的异常累积。正常情况下,肝细胞摄取自由脂肪酸,以甘油三酯的形式储存在脂滴中,脂滴可以通过水解或自噬来降解。然而,过度摄取脂肪酸或者脂质的转运障碍会使胞内脂滴富集,导致脂毒性,促使NAFLD的发生,进一步发展为炎症并可导致NASH。脂毒性和炎症是促进NAFLD发展的两个主要因素。mTOR以多条通路参与了肝细胞异常的脂质累积和炎症的发展。

2.1 调节脂质代谢

肝细胞脂毒性损伤是NAFLD的主要原因及表现。脂滴的清除对于维持肝脏正常功能至关重要。在脂质代谢方面,mTORC1通过2条以转录因子为中心的轴驱动脂质合成,分别是胆固醇调节元件结合蛋白1/2(sterol regulatory element-binding protein 1/2,SREBP1/2)和过氧化物酶体增殖激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)[5]。胆固醇调节元件结合蛋白转录调控脂质的合成和脂质稳态,其包括三种异构体,其中SREBP-1a激活脂肪酸和胆固醇合成,SREBP-1c激活脂肪酸合成,SREBP-2与胆固醇合成和摄取相关[6]。mTORC1则激活SREBP-1促进脂质的合成[7]。在NAFLD小鼠模型实验中,学者证实mTORC1可以下调SREBP-1c的抑制因子——细胞周期激酶8(cyclin-dependent kinases 8,CDK8),从而避免SREBP-1c的泛素化降解,实现脂质从头合成的持续激活[8]。在机制上,mTORC1直接磷酸化下游分子SREBP的抑制剂磷脂酸磷酸酶lipin1并抑制其核进入,促进SREBP上调脂质从头合成和胆固醇合成的基因,并且通过下调PPARγ活性抑制脂噬、脂肪酸氧化和生酮[9-10]。最近有动物实验证实中药猪胆的主要活性成分猪去氧胆酸通过调控PPARα细胞核定位改善肝脏脂质累积[11]。转录因子FOXK1也参与了mTORC1下游脂质代谢的调控,在小鼠肝细胞mTORC1激活条件下,与脂质分解代谢相关的4个基因Ppara,Acadm,Decr1和Etfa,以及与脂质合成代谢相关的2个基因Scap和Hacd2,都是FOXK1的直接靶点[12]。

mTOR下游分子众多,除了通过调节4E-BP1和S6K1等靶点发挥广泛的作用,同时还控制许多转录因子的活性,从而控制基因的表达。因此,仅对少数mTOR靶标进行磷酸化就可以产生广泛的影响,导致在以mTOR为靶点治疗NAFLD等脂质代谢疾病时可能会产生一些额外的效应,因此特异性阻断肝细胞内调节脂质稳态的mTORC1通路十分有意义。先前有研究揭示在非肝细胞中mTORC1招募底物方式的多样性,滤泡素(folliculin,FLCN)可以赋予mTORC1底物特异性,FLCN功能突变导致mTOCR1底物转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)和转录因子E3(transcription factor E3,TFE3)的持续磷酸化,而不影响经典磷酸化底物S6K1和4E-BP1的激活[13]。FLCN可以和卵泡刺激结合蛋白(folliculin-interacting protein 1,FNIP1)或FNIP2形成复合物,介导RagC或RagD的GTP水解,促进Rag C/DGTP向Rag C/DGDP转换。而TFEB和TFE3是同源螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)亮氨酸拉链转录因子,可调节/参与溶酶体生物发生、自噬和脂质代谢。TFEB和TFE3在饥饿时转移到细胞核中激活靶基因。在营养充足时,它们被mTORC1磷酸化,被滞留在细胞质中。Gosis等[14]研究表明,通过敲除肝细胞中FLCN可以特异调节TFE3的入核,激活溶酶体基因转录,保护小鼠免受NAFL和NASH的困扰。笔者实验发现,肝脏特异性敲除FLCN对肝脏脂质稳态的多个方面产生有利影响,包括促进脂肪酸氧化和抑制新生脂肪生成;进一步研究发现,FLCN敲除后,TFE3得到释放进入细胞核,诱导INSIG2抑制SREBP-1c蛋白水解和激活,最终导致脂质从头合成得到抑制。另一方面,FLCN的缺失会导致TFE3的结合模式和结合强度都发生改变,全基因范围内,TFE3结合定位于SREBP-1c附近,这种定位位置的接近性不仅不会竞争性地与染色质结合,相反,SREBP-1c的存在反而协同促进了TFE3与靶基因的结合。这一结果也在小鼠中得到证实,肝脏特异性敲除FLCN保护缺乏胆碱和氨基酸的高脂饮食(choline-deficient amino acid-defined and high fat,CDAA-HF)喂养小鼠免受NAFLD和NASH,甚至可以逆转NAFLD和NASH的脂肪变性水平和炎症水平。以上研究表明,mTOR通路的激活主要通过转录因子SREBP-1c来增加肝细胞异常的脂质累积。

2.2 mTOR与自噬

自噬通过多种方式调节肝脏代谢[15],在NAFLD和脂肪性肝炎等疾病中发挥着关键作用[16]。脂滴的自噬降解称为脂噬,是脂质降解的重要代谢途径。Singh等[17]首次阐明自噬调节脂质代谢的功能,他们发现,无论在体外肝细胞还是小鼠体内肝脏,抑制自噬都可以增加甘油三酯和脂滴的累积;此外,二者之间还存在反向关系,脂质的异常累积损伤自噬功能,因此形成负性循环,即脂质的累积抑制自噬功能,导致体内脂质的累积进一步增多。Nakadera等[18]进一步证实了这一结论,并阐明了肝脂肪变性引起了囊泡型腺苷三磷酸酶(vacuolar-type adenosine triphosphatases,V-ATPase)下调,通过破坏溶酶体和自噬泡酸化导致自噬功能障碍。作为自噬的中枢调节因子,mTORC1在通过调节脂噬来实现脂滴清除中的作用不可或缺。He等[19]发现,禁食或者高脂饮食诱导小鼠肝脏乙酰辅酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1,ACOX1)的富集,使得胞质中乙酰辅酶A的水平升高,进一步乙酰化Raptor,促进mTOR的溶酶体定位激活,抑制了肝脏累积脂滴的自噬降解,从而促进NAFLD的发展。而在上述Gosis等[14]的研究中,肝脏特异性敲除FLCN不仅促进了脂肪酸氧化,还增加了溶酶体生成。这些研究都表明,在脂质代谢异常条件下mTOR被激活,自噬水平被抑制,导致脂质在肝细胞中进一步累积,从而诱导疾病进展。

2.3 mTOR与炎症

炎症的发生是NAFLD发展为NASH的标志,肝细胞脂肪变性和炎症共同损伤肝细胞正常功能,导致肝组织的慢性损伤。炎症通常发生在肝脂肪变性之后,一方面,肝细胞脂质的异常累积可以导致炎症的发生;另一方面,炎症也会影响肝脏脂滴的清除,扰乱胆固醇代谢,加速脂质累积[20],是NAFLD的独立危险因素。许多研究都证明了炎症通过mTOR扰乱脂质代谢,例如,炎症通过促进mTOR及其下游的磷酸化,增加了脂肪酸转运蛋白CD36的翻译效率,促进了脂质的积累[21]。在炎症小鼠模型和IL-1β刺激的HepG2细胞系中都表现出脂质的累积,mTORC1的沉默抑制了这一现象,表明mTORC1参与了炎症刺激的脂毒性[22]。mTOR参与了高脂饮食诱导的大鼠发生NAFLD以及棕榈酸诱导HepG2细胞产生炎症[23],表明NAFL向NASH的进展过程可能与mTOR的活化相关。干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes,STING)识别来源于病原体或细胞内异常的双链DNA,激活下游IRF3、NF-κB等信号通路,刺激干扰素和炎症因子的转录[24]。多项研究揭示了NAFLD患者以及高脂饮食诱导的肝脂肪变性小鼠肝组织STING的表达增加,STING的敲除缓解了炎症状态,减少了肝细胞中脂质的沉积,表明STING在NAFLD炎症的发生中具有重要作用[25-27]。同时,另有研究表明STING的激活还参与了mTORC1调控的脂滴自噬降解,STING1直接参与mTORC1的形成,此过程依赖自噬相关蛋白SQSTM1[28]。以上结果都证实了mTOR在炎症促进脂质积累中发挥了重要作用,反过来从单纯的脂肪变性到肝脏炎症的具体机制还有待进一步研究。

3 总结

关于NAFLD的发病机制,近年来取得了许多研究进展,包括表观遗传、肝细胞内的信号通路、肝脏内的细胞互作等;随着对NAFLD研究的逐渐加深,越来越多的证据表明NAFLD患者广泛合并代谢紊乱特征。mTOR作为调控代谢的枢纽,在NAFLD发展过程中的重要作用被不断揭示:一方面,mTOR调控细胞脂质的合成与分解,加重脂质累积;另一方面,自噬作为一种细胞降解途径,被感知细胞营养而激活的mTOR抑制,导致脂噬的减少,进一步加重脂质负担,促进NAFLD的发生。炎症是促使NAFLD发展的关键因素,多项研究证实mTOR还参与了炎症因素导致的脂质代谢紊乱。此外,多篇研究指出mTOR在NAFLD向肝细胞癌进展的过程中也发挥了关键作用[29-30]。综上所述,以mTOR为靶点有望成为NAFLD治疗的新切入点。