痰常规培养和RT-PCR对链球菌和克雷伯菌肺炎的鉴别价值

曾燕 张金平 刘扬成 张传圣

【摘要】 目的 探讨链球菌和克雷伯菌肺炎诊断中痰常规培养和实时荧光定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain

reaction，RT-PCR）的应用价值。方法 选取2022年6月—2022年12月在会昌县中西医结合医院就诊的78例疑似链球菌肺炎患者与克雷伯菌肺炎患者作为研究对象，结合临床症状、影像学和培养法检测结果，确诊单一病原体感染肺炎。对患者进行痰常规培养和RT-PCR检测，比较2种检测方法的阳性检出率和诊断价值。结果 RT-PCR检测在肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，S.pn）、肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，Kpn）中的检出率较痰常规培养更高（P＜0.05）；RT-PCR检测在S.pn、Kpn诊断中的灵敏度和阴性预测值较痰常规培养更高（P＜0.05）。结论 在链球菌和克雷伯菌肺炎诊断过程中，RT-PCR检测的应用能够提高阳性诊断率，为后续治疗提供依据。

【关键词】 痰常规培养；荧光实时定量聚合酶链反应；肺炎链球菌；肺炎克雷伯菌

文章编号：1672-1721（2024）04-0106-03     文献标志码：A     中国图书分类号：R563.1

肺炎链球菌（S.pn）、肺炎克雷伯菌（Kpn）感染是导致肺炎发生的重要原因之一。前者属于革兰阳性球菌，可导致脑膜炎、支气管炎等疾病的发生。后者属于革兰阴性杆菌，正常人群携带率约为10%，可导致肺部感染的发生[1]。有资料显示，发展中国家5岁儿童中，S.pn所导致的肺炎病死率达到500万人/年。广谱抗生素是治疗肺炎的有效方法，但滥用容易导致耐药菌的产生，不利于疾病治疗，会增加患者病死风险，因此，应在疾病发生早期进行及时明确的诊断[2]。痰常规培养在临床中的应用较为广泛。近几年，随着分子生物学检验实验室在县级医疗和疾控机构的普及，RT-PCR检测方法逐渐得到应用，但临床对于2种检测方式在S.pn和Kpn中的应用价值未进行探讨。基于此，本研究对78例患者进行研究，旨在探讨不同检测方式对链球菌和克雷伯菌肺炎阳性检出率和诊断价值的影响，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2022年6月—2022年12月会昌县中西医结合医院收治的78例肺炎患者作为研究对象，其中男性42例、女性36例；年龄2～87岁，平均年龄（42.39±3.27）岁；合并吸烟史者35例。本研究经医院医学伦理委员会审批，患者及其家属知情并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：年龄2～87岁；存在发热、胸痛、咳嗽、咳痰、呼吸困难或呼吸音异常等症状；影像学检测肺部存在异常；临床资料完整。

排除标准：病毒性感染肺部疾病者；合并恶性肿瘤者；免疫抑制者；合并其他肺部疾病者。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

患者使用质量分数为0.9%的氯化钠注射液（北京天坛生物制品股份有限公司，国药准字S10870001）漱口，同时使用质量分数为0.9%的氯化钠注射液对口腔残留物质进行冲洗，将深处痰液咳出，置于无菌盒中。若患者无法顺利咳出痰液，则使用15 mL 45 ℃质量分数为0.9%的氯化钠注射液对患者进行雾化或无菌操作以吸痰取样。取样后立即将样本送至实验室进行检测。通过显微镜观察标本是否合格，其中鳞状上皮细胞≤10个/低倍视野、多核白细胞≥25个/低倍视野为合格。样本不合格则需重新采样送检。分取部分痰液进行痰常规培养，另取1 mL标本转移到环氧己烷灭菌螺口管中进行RT-PCR检测。若超过24 h不能及时检测，需置-80 ℃条件下保存。

1.3.2 痰常规培养

按照《全国临床检验操作规程》进行痰常规培养，取痰液脓性部分，分别接种于血平板（广州市迪景微生物科技有限公司，粤械注准20172400071）、伊红美蓝琼脂平板（广州市迪景微生物科技有限公司，粤械注准20152400485）、巧克力琼脂平板（广州市迪景微生物科技有限公司，粤穗械备20150086号）中，放入培养箱中，培养时间为24 h，温度36 ℃，CO2含量5%。经革兰染色（珠海贝索生物技术有限公司，粤珠械备20170095）镜检，初步观察后，用全自动细菌鉴定系统（湖南迈瑞医疗科技有限公司，湘械注准20172220232）、革兰阴性菌鉴定及药敏试条（温州市康泰生物科技有限公司，浙械注准20152400399）、革兰阳性菌鉴定及药敏试条（温州市康泰生物科技有限公司，浙械注准20152400298）对克雷伯菌和链球菌进行鉴定。

1.3.3 RT-PCR检测

吸取4 mL质量分数为4%的氢氧化钠溶液加入待测样本螺口管内，充分摇匀，室温下静置30 min，后取0.5 mL混合液，置入离心管，加入0.5 mL氢氧化钠，静置10 min，设置离心机转速为13 000 r/min，5 min后加入1 mL质量分数为0.9%的氯化钠注射液，离心5 min，在沉淀物中加入DNA提取液（天根生化科技有限公司，2022WO117），沸水浴10 min，离心5 min，将其作为反应模板。阴性对照，取3 mL水样，离心机离心2 min，将DNA提取液加入沉淀物中，沸水浴10min，设置离心机转速13 000 r/min，5 min后取上层清液。稀释阳性对照品为标准品。按试剂盒说明（17∶3）配置PCR反应体系，漩涡混匀器上混匀，按每个反应体系为20 μL，分装到8联管内，提取样本、封盖、离心，利用PCR仪（ABI 7500型扩增仪）进行扩增，扩增试剂为广州达安生物科技有限公司生产（20220826/20220718），扩增条件为50 ℃×2 min、95 ℃×15 min、94 ℃×15 s、55 ℃×45 s，循环40次。

1.4 观察指标

整个过程中，主要观察指标如下。（1）比较2种检测方法的阳性检出率；（2）比较2种检测方式的诊断效能，即对灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值进行对比。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，计量资料以x±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 痰常规培养和RT-PCR检测阳性检出率比较

与痰常规培养相比，RT-PCR在S.pn、Kpn中的阳性检出率更高（P＜0.05），见表1。

2.2 痰常规培养和RT-PCR检测诊断价值比较

与痰常规培养相比，RT-PCR检测在S.pn、Kpn诊断中有着更高的灵敏度和阴性预测值（P＜0.05），见表2。

3 讨论

Kpn、S.pn是导致肺炎发生的主要致病菌[3]。Kpn是一种条件致病菌，属于呼吸道的菌群之一，是临床中发现最早的可导致肺炎发生的革兰阴性杆菌。身体虚弱人群尤其住院患者更易感染Kpn。Kpn经呼吸道感染，住院患者使用呼吸器、人工导管或雾化过程中容易发生交叉感染，从而导致肺炎的发生。Kpn可导致婴幼儿发生肺炎、肠炎、败血症等。随着临床抗菌药物的使用，耐药菌逐渐增多，革兰阴性杆菌肺炎（gram-negative bacillary pneumonia，GNBP）发生率增加。这也是导致社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）和医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）发生的重要原因，病死率较高[4]。S.pn在自然界分布广泛，其中大部分在人体鼻咽部定植，对健康人群无明显危害，但对于免疫力较低的婴幼儿及老年人群，极易导致呼吸道感染等疾病的发生，已成为现阶段世界范围内主要致病原之一。随着光谱抗生素的不当使用甚至滥用，耐药菌感染越来越普遍，细菌耐药性逐渐加强，尤其是革兰阴性菌。在疾病发生早期尽快明确致病菌，合理选用抗生素，临床对症治疗，对患者康复有着极为重要的意义。

呼吸道标本培养是临床常见的检测方式，包括胸腔积液培养、肺泡灌洗液培养、痰常规培养等。取灌洗液或胸腔积液对细菌进行培养是现阶段肺炎诊断的“金标准”，对疾病诊断有着确定性的意义，但这种操作方式具有一定创伤性，对医生操作技术水平要求较高，存在并发症发生的风险，因此未普遍应用[5]。

痰常规培养是临床应用较多的病原学检测方式，通过对下呼吸道分泌物进行培养分析，能够反映感染情况，为后期用药提供指导。在临床研究中发现，痰常规培养存在一定局限性，检测需要较长时间，在有氧环境下细菌一般在6～8 h开始生长，厌氧菌一般需2～4 d。对于不典型病原体，在肺炎发生早期检测中不能及时得到准确的结果。检测结果受药物使用及标本采集质量影响较大。有研究人员发现，在使用过抗生素患者中，S.pn分离率明显下降[6]。

PCR又名体外扩增，是一种新型检测方式，用时较短，结果准确率高，有效弥补了常规培养方式的不足，它在基因表达中的应用更有利于疾病诊断，在多种遗传疾病、传染性疾病、下呼吸道感染中的应用效果较好。实时荧光定量PCR与PCR原理相同，是检测领域的新技术，在保留PCR检测优势的同时，解决了检测过程准确定量和灵敏度的问题，能够重复进行检测，并监控检测过程[7]。

有研究人员对慢性肺部疾病患者痰液进行培养，结果显示S.pn检出率较低[8]。本研究中，痰常规培养S.pn、Kpn的阳性检出率、灵敏度和阴性预测值较低，这与上述研究结果相一致。究其原因，细菌痰培养结果受多种因素影响，标本获取、培养过程中的相关操作均会影响检测准确性，以及部分患者存在抗生素使用情况，导致培养结果呈现假阴性。痰液中细菌的分布是不均匀的，在检测痰液脓性部分时，可能存在标本选取不当或生长不良的情况，降低检测阳性率。S.pn为苛养菌，痰培养所需时间较长，从样本送检到出具报告一般需要2～3 d。患者使用抗生素治疗及各种原因导致敏感性下降，不利于快速给予准确的临床用药指导。本研究中，RT-PCR检测中S.pn、Kpn的阳性检出率、灵敏度和阴性预测值较痰常规培养更高，提示RT-PCR检测的应用价值较高。究其原因，RT-PCR在S.pn、Kpn检测中更能体现自身优势，通过少量呼吸道分泌物便可明确病原菌，更适用于S.pn、Kpn等导致的缺乏特异性症状的感染诊断中。RT-PCR检测中Kpn、S.pn阳性检出率较高，但仍未完全检出，原因可能为：采集标本不当，影响检测准确性；细菌检测标本不同，国外在进行RT-PCR检测时多通过防污染毛刷、肺泡灌洗等方式获取标本，国内多从痰液中获取标本；细菌DNA未能成功提取；相关致病菌数量过多。

综上所述，RT-PCR检测在链球菌和克雷伯菌肺炎诊断中的阳性检出率较高，灵敏度和阴性预测值较痰常规培养更高，诊断价值较好，可推广使用。

基金项目：赣州市科技计划项目（20222ZDX7846）

参考文献

[1] 司雪菲.100例肺炎克雷伯杆菌急性下呼吸道感染病人痰液细菌培养及对抗菌药物耐药性分析[J].疾病监测与控制，2020，14（3）：178-180.

[2] 贾晓芸，陈宏君，吴林媛.呼吸道病原核酸检测法在小儿肺炎链球菌感染中的临床应用[J].岭南急诊医学杂志，2021，26（4）：412-414.

[3] BAUTISTA L，PILL-PEPE L，KAPOOR N，et al.Addition of lauryldimethylamine N-Oxide （LDAO） to a copper-free click chemistry reaction improves the conjugation efficiency of a cell-free generated CRM197 variant to clinically important streptococcus pneumoniae serotypes[J].ACS Omega，2022，7（39）：34921-34928.

[4] BAVARO D F，BELATI A，DIELLA L，et al.Prompt and appropriate antimicrobial therapy improves outcomes of NDM-producing and KPC-producing klebsiella pneumoniae bloodstream infections in patients hospitalized for COVID-19：a comparative retrospective case-series[J].Antibiotics（Basel），2022，11（11）：1519.

[5] 程弘夏，付敏，周立，等.多重RT-PCR方法对人肺炎链球菌菌种、血清型及耐药性的鉴别检测[J].信阳师范学院学报（自然科学版），2018，31（1）：32-39.

[6] 李媛，熊樱，易佰城，等.应用实时荧光PCR快速检测血培养标本中的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌[J].国际检验医学杂志，2021，42（8）：921-924.

[7] 胡慧，李田美，姜艳芬.蜡样芽孢杆菌、产色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌三重PCR检测方法建立与应用[J].动物医学进展，2022，43（7）：1-6.

[8] 洪林杰，黄种杰，范洪涛，等.老年慢性阻塞性肺疾病患者合并呼吸机相关性肺炎的病原菌分布变迁及耐药性分析[J].疑难病杂志，2018，17（3）：226-229.

（编辑：郭晓添）

作者简介：曾 燕，女，本科，主治医师。