丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及TGF-β1/Smad2信号通路的影响

谭珍妮，吕春美，邹海林

摘要 目的：探讨丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad2信号通路的影响。方法：72只SD大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组、丹曲林高剂量＋SRI-011381（TGF-β激动剂）组，每组12只。丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组大鼠分别腹腔注射5、10 mg/kg丹曲林；阳性对照组大鼠灌胃20 mg/kg 维拉帕米；丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠腹腔注射10 mg/kg丹曲林和30 mg/kg SRI-011381；空白对照组、模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每日1次，持续4周。4周后，除空白对照组外，其余各组大鼠均按1 mL/kg尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液（乙酰胆碱66 μg/mL＋氯化钙10 mg/mL）构建心房颤动模型，空白对照组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水，每日1次，持续1周，1周后采集心电图数据并记录心房颤动诱发时间；彩色多普勒超声仪检测左室舒张末期内径（LVEDD）、左室缩短分数（LVFS）、左室射血分数（LVEF）、左室收缩末期内径（LVESD）的变化；苏木精-伊红（HE）染色检测大鼠心肌组织病理损伤；Masson染色检测大鼠心肌纤维化；免疫组化法检测心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（COL-Ⅲ）表达；酶联免疫吸附测定法（ELISA）法检测心肌组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）水平；蛋白质免疫印迹法（Western Blot）检测TGF-β1、p-Smad2、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达。结果：与空白对照组比较，模型组大鼠心律不齐，心肌组织病理损伤及纤维化严重，LVEDD、LVESD、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达及IL-1β、TNF-α水平以及TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达升高，LVFS、LVEF降低（P＜0.05）；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组对应指标变化趋势与上述相反，且丹曲林浓度越高，对应的变化趋势越明显（P＜0.05）；SRI-011381减弱了高剂量丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应的抑制作用。结论：丹曲林可能通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路减轻心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应。

关键词心房颤动；心肌纤维化；丹曲林；转化生长因子-β1/Smad2信号通路

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.009

Effects of Dantrolene on Myocardial Fibrosis and TGF-β1/Smad2 Signaling Pathway in Rats with Atrial Fibrillation

TAN Zhenni， LYU Chunmei， ZOU Hailin

The First Affiliated Hospital of Shaoyang College， Shaoyang 422000， Hunan， China， E-mail： a13827232348@126.com

AbstractObjective：To investigate the effects of dantrolene on myocardial fibrosis and transforming growth factor-β1（TGF-β1）/Smad2 signaling pathway in atrial fibrillation rats.Methods：Seventy-two SD rats were randomly divided into blank control group，model group，dantrolene low-dose group，dantrolene high-dose group，positive control group，dantrolene high-dose＋SRI-011381（TGF-β agonist） group，with 12 rats in each group.Dantrolene low-dose group and dantrolene high-dose group were intraperitoneally injected with 5 and 10 mg/kg dantrolene，respectively;rats in positive control group were given 20 mg/kg verapamil;rats in dantrolene high-dose＋SRI-011381 group were intraperitoneally injected with 10 mg/kg dantrolene and 30 mg/kg SRI-011381，respectively;rats in blank control group and model group were intraperitoneally injected with equal volume of normal saline once a day for 4 weeks.After 4 weeks，except for the blank control group，the rats in the other groups were injected 1 mL/kg of acetylcholine-calcium chloride mixed solution（acetylcholine 66 μg /mL＋calcium chloride 10 mg/mL） through the tail vein to construct the atrial fibrillation model.The rats in the blank control group were injected with equal volume of normal saline through the tail vein once a day for 1 week.One week later，ECG data were collected and the onset time of atrial fibrillation was recorded.The changes of left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD），left ventricular shortening fraction（LVFS），left ventricular ejection fraction（LVEF），and left ventricular end-systolic diameter（LVESD） were detected by color Doppler ultrasound.Hematoxylin-eosin（HE） staining was used to detect pathological injury of myocardium in rats.Masson staining was used to detect myocardial fibrosis in rats.The expressions of type Ⅰ collagen（COL-Ⅰ） and type Ⅲ collagen（COL-Ⅲ） were detected by immunohistochemistry.The levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α） and interleukin-1β（IL-1β） in myocardial tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The protein expression of TGF-β1，p-Smad2 and α-smooth muscle actin（α-SMA） were detected by Western Blot.Results：Compared with the blank control group，the model group rats showed arrhythmia，serious myocardial tissue pathological damage and fibrosis，positive expression of LVEDD，LVESD，COL-Ⅰ，COL-Ⅲ，IL-1β，TNF-α，and TGF-β1，p-Smad2，α-SMA protein expression increased，LVFS，LVEF decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the change trend of corresponding indicators in dantrolene low-dose group，dantrolene high-dose group and positive control group were opposite to the above data，and the higher the concentration of dantrolene，the more obvious the corresponding change trend（P＜0.05）.SRI-011381 attenuated the inhibitory effect of high-dose dantrolene on myocardial fibrosis and inflammation in rats with atrial fibrillation.Conclusion：Dantrolene may reduce myocardial fibrosis and inflammation in rats with atrial fibrillation by inhibiting TGF-β1/Smad2 signaling pathway.

Keywordsatrial fibrillation; myocardial fibrosis; dantrolene; transforming growth factor-β1/Smad2 signaling pathway

心房颤动（atrial fibrillation，AF）是临床上最常见的心律失常之一，是脑卒中、心力衰竭、猝死和心血管疾病的主要原因之一，具有较高的致残率和死亡率［1］。随着人口老龄化的加剧，心房颤动的发病率和患病率持续上升，社会负担不断增加［2］。研究表明，心房颤动的主要病理基础是心房重构，包括心房电重构、结构重构和神经重构，其中，心肌纤维化在心房结构重构的发生和发展中起关键作用［3］。丹曲林（dantrolene，DA）是一种兰尼碱受体拮抗剂，研究显示，丹曲林可降低心肌梗死心力衰竭大鼠心房颤动诱导率，并减少心房肌纤维化［4］。而关于丹曲林减轻心房颤动大鼠心肌纤维化的具体机制尚未明确。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad2信号通路作为调控组织纤维化的通路之一，已有研究显示，抑制TGF-β1/Smad2信号通路可以抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心房纤维化［5］。而丹曲林能否通过调控TGF-β1/Smad2信号通路影响心房颤动中的心肌纤维化尚不清楚。因此，本研究探究丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及TGF-β1/Smad2信号通路的影响及其作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物

8周龄无特定病原体（SPF）级雄性SD大鼠72只，体质量210～230 g，购自吉林大学实验动物中心，许可证号为SYXK（吉）2021-0006。所有动物的使用获得本院动物护理和使用委员会的批准，并符合实验动物护理和使用指南。

1.2主要试剂

丹曲林（货号：MBS5759247）、TGF-β激动剂SRI-011381（货号：MBS5750430-C）购自艾美捷科技公司；乙酰胆碱（货号：sl8799）购自北京康瑞纳生物公司；氯化钙（货号：L13191）购自北京泽平生物公司；维拉帕米（verapamil，VEP）（货号：CS-O-30814）购自深圳海思安生物公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（货号：EK-R38696）购自博辉生物科技（广州）公司；白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）试剂盒（货号：F15810）购自上海西唐生物公司；Masson染色试剂盒（货号：00177B）购自上海圻明生物公司；兔源一抗Ⅰ型胶原蛋白（collagen Ⅰ，COL-Ⅰ）（货号：ab270993）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen Ⅲ，COL-Ⅲ）（货号：ab6310）、TGF-β1（货号：ab215715）、p-Smad2（货号：ab280888）、Smad2（货号：ab40855）、β-actin（货号：ab8226）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（货号：ab205718）均购自Abcam公司；兔源一抗α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）（货号：YM-H0645）购自上海远慕生物公司。

1.3心房颤动大鼠模型的构建及分组

采用随机数字表法将72只SD大鼠分为空白对照组、模型组、丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组、丹曲林高剂量＋SRI-011381（TGF-β激动剂）组，每组12只。丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组大鼠分别腹腔注射5、10 mg/kg丹曲林［4］；阳性对照组大鼠灌胃20 mg/kg 维拉帕米［6］；丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠腹腔注射10 mg/kg丹曲林和30 mg/kg的SRI-011381［7］；空白对照组、模型组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每日1次，持续4周。4周后，除空白对照组外，其余各组大鼠均按1 mL/kg尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙混合液（乙酰胆碱66 μg/mL＋氯化钙10 mg/mL）构建心房颤动模型［8-10］，空白对照组大鼠尾静脉注射等体积生理盐水，每日1次，持续1周，1周后进行后续实验。

1.4心电图数据的采集

应用1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，利用电子心电图机进行肢体导联，采集心电图数据并记录心房颤动诱发时间。

1.5心功能指标的检测

利用彩色多普勒超声仪检测大鼠左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）。

1.6苏木精-伊红（HE）染色检测大鼠心肌组织病理学变化

每组选取6只大鼠，麻醉并处死大鼠，收集心肌组织并在4%多聚甲醛中固定24 h，经脱水、石蜡包埋、切片后，用HE染色。在光学显微镜下观察组织切片的病理变化。

1.7Masson染色检测大鼠心肌纤维化

取1.6中的心肌组织切片，按照Masson染色试剂盒步骤进行Masson染色，每张切片随机选取6个视野，用光学显微镜观察心肌组织纤维化情况，Image J软件用于分析胶原面积。胶原面积百分数（%）＝蓝染区域面积/整个视野面积×100%。

1.8免疫组化法检测心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达

取1.6中的心肌组织切片，将切片脱蜡、水化、抗原修复后，加入一抗COL-Ⅰ（1∶1000）、COL-Ⅲ（1∶2 000）在4 ℃下过夜孵育，再将切片与山羊抗兔二抗（1∶1 000）一起温育1 h，再进行DAB显色、苏木精复染，最后在光学显微镜下观察心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表达。

1.9酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测心肌组织中TNF-α、IL-1β水平

每组选取剩余的6只大鼠，麻醉并处死大鼠，收集心肌组织，严格按照试剂盒操作步骤检测心肌组织匀浆中IL-1β、TNF-α水平。

1.10蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达

取1.9中的心肌组织，用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液提取总蛋白。将50 μg蛋白质经电泳、转膜、封闭后，将膜与一抗TGF-β1（1∶2 000）、Smad2（1∶1 000）、p-Smad2（1∶2 000）、α-SMA（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）在4 ℃下孵育过夜，然后与HRP偶联的二抗（1∶1 000）孵育1 h。采用Image LabTM软件分析蛋白质的相对表达水平。

1.11统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析和Tukey检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1丹曲林对心房颤动大鼠心房颤动诱发时间的影响

心电图显示，空白对照组可见明显p波，心率正常；模型组、丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组、丹曲林高剂量＋SRI-011381组中的p波被不规则的f波代替，呈现不同程度的心律不齐。详见图1。空白对照组大鼠无心房颤动发生；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心房颤动诱发时间延长（P＜0.05）；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心房颤动诱发时间延长（P＜0.05）；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠心房颤动诱发时间缩短（P＜0.05）。详见表1。图1丹曲林对心房颤动大鼠心电图的影响

2.2丹曲林对心房颤动大鼠心功能的影响

与空白对照组比较，模型组LVEDD、LVESD升高，LVFS、LVEF降低（P＜0.05）；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组LVEDD、LVESD降低，LVFS、LVEF升高（P＜0.05）；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组LVEDD、LVESD降低，LVFS、LVEF升高（P＜0.05）；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组LVEDD、LVESD升高，LVFS、LVEF降低（P＜0.05）。详见表2。

2.3丹曲林对心房颤动大鼠心肌组织病理损伤的影响

空白对照组大鼠心肌细胞结构完整，排列整齐；模型组大鼠心肌细胞结构异常，细胞肿胀且排列无规则；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织病理损伤有所改善；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织病理损伤减轻；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠心肌组织病理损伤严重。详见图2。

2.4丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠胶原面积百分数增加（P＜0.05）；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠胶原面积百分数降低（P＜0.05）；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠胶原面积百分数降低（P＜0.05）；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠胶原面积百分数升高（P＜0.05）。详见图3、表3。

2.5丹曲林对心房颤动大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达增多；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达减少；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达减少；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达增多。详见图4。

2.6丹曲林对心房颤动大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β水平的影响

与空白对照组比较，模型组TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05）；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组TNF-α、IL-1β水平降低（P＜0.05）；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）。详见表4。

2.7丹曲林对心房颤动大鼠心肌组织中TGF-β1/Smad2通路蛋白及纤维化相关蛋白α-SMA表达的影响

与空白对照组比较，模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达降低（P＜0.05）；与丹曲林低剂量组比较，丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达降低（P＜0.05）；与丹曲林高剂量组比较，丹曲林高剂量＋SRI-011381组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2、α-SMA蛋白表达升高（P＜0.05）。详见图5、表5。

3讨论

心肌纤维化在心房颤动的发生发展过程中具有重要作用［11］。乙酰胆碱-氯化钙混合液诱导心房颤动是常用于构建心房颤动模型的方式之一［12］。本研究利用此方法构建心房颤动大鼠模型，结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠心律不齐，心肌组织病理损伤及心肌纤维化严重，心功能指标LVEDD、LVESD升高，LVFS、LVEF降低，提示心房颤动大鼠模型构建成功。α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ是常用于评估心肌纤维化的指标，其表达越高，表明纤维化程度越严重［13］。本研究结果显示，模型组大鼠心肌组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ阳性表达及α-SMA蛋白表达明显高于空白对照组，再次证明了心房颤动模型大鼠心肌纤维化严重。炎症与心房颤动的病理生理学有关，过多的炎症介质扩散到心房组织中，改变心房组织的结构和电特性，进而增加心房颤动的可诱导性［14］。与空白对照组比较，模型组TNF-α、IL-1β水平升高，提示除了心肌纤维化外，炎症反应也参与了心房颤动的进展。

丹曲林作为一种兰尼碱受体阻滞剂，已被批准用于治疗慢性痉挛、恶性高热和抗精神病恶性综合征的治疗［15］。关于丹曲林在心血管疾病方面的研究较多，如丹曲林可降低心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常的易感性［16］；丹曲林干预可改善慢性心力衰竭大鼠心功能［17］；丹曲林能够拮抗糖尿病家兔心房肌纤维化［18］。以上研究均表明丹曲林可抑制心血管疾病的进展，与本研究结果一致。本研究也显示，丹曲林可抑制心房颤动大鼠炎症反应、心肌组织病理损伤及纤维化，改善心功能及心率，且丹曲林浓度越高对应的趋势越明显，而丹曲林高剂量组与阳性对照组上述对应指标变化的比较差异无统计学意义，提示丹曲林可对心房颤动大鼠发挥保护作用。

TGF-β1是纤维化、炎症等病理疾病发展的主要介质，其作用由Smad2分子信号所介导［19］。研究显示，抑制TGF-β1/Smad2信号通路可减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化［20］；抑制TGF-β1可以改善四氯化碳诱导的肝纤维化［21］；降低受损心肌组织中TGF-β1蛋白表达水平能发挥对心肌梗死大鼠心肌组织的保护作用［22］。而关于TGF-β1/Smad2通路在心房颤动大鼠心肌纤维化中的作用鲜有报道。本研究显示，与模型组比较，丹曲林低剂量组、丹曲林高剂量组、阳性对照组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2蛋白表达降低，且丹曲林浓度越高，对应蛋白质表达降低的趋势越明显，而丹曲林高剂量组与阳性对照组对应蛋白质表达变化差异无统计学意义，推测丹曲林可能通过抑制TGF-β1/Smad2通路抑制心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应。为了证明该猜想的合理性，本研究在高剂量丹曲林干预的基础上再加TGF-β激动剂SRI-011381处理心房颤动大鼠，结果显示，SRI-011381减弱了高剂量丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应的抑制作用，证实了丹曲林可能通过抑制TGF-β1/Smad2通路抑制心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应。

综上所述，丹曲林可能通过抑制TGF-β1/Smad2通路抑制心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应。丹曲林可能成为治疗心房颤动的潜在药物。然而，本研究尚存在不足之处，丹曲林对心房颤动大鼠心肌纤维化及炎症反应的抑制作用涉及的通路较多，有待后续进一步探究。

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（收稿日期：2022-06-19）

（本文编辑邹丽）