基于TLR4信号通路探讨宣肺化湿止咳汤干预CVA豚鼠气道重塑机制研究

★ 罗惠娥 范亚国 何军 丁兆辉（.江西中医药大学 南昌 330006；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是临床较为常见的哮喘类型，以干咳为主要症状，症状常在夜间、凌晨或运动时加剧，虽然没有典型哮喘的呼吸困难症状，但仍然存在气道高反应性和慢性炎症症状［1］。目前，我国CVA的发生率呈明显上升趋势，引起专家学者的广泛关注和重视［2］。CVA的发病机制尚未完全明确，主要改变涉及气道重塑、气道高反应性、气道炎症等［3］。慢性炎症损伤气道上皮细胞，长期暴露的迷走神经末梢会使感受器兴奋阈值下降，容易被微小的刺激激惹，使小气道收缩，刺激神经末梢咳嗽感受器，使患者发生咳嗽［4-5］。CVA是由细胞因子、炎症因子、炎症介导、变态反应性炎症等多种机制引起。TOLL样受体（TLR）是从果蝇身上发现的模式识别受体，能够通过对病原体的识别及相关炎症因子的调节以激活固有免疫及适应性免疫系统，与哮喘的发生密切相关。TLR属于跨膜糖蛋白，TLR4可能介导CVA。作为固有免疫系统中结构和生物学特性剖析比较透彻的模式识别受体，TLR4与CVA的发病有着密切的关系［6］。气道上皮细胞TLR4的表达参与吸入过敏原介导的嗜酸性粒细胞反应。这证明不同细胞表达的TLR4对吸入过敏原产生的免疫应答具有不同程度的调控作用［7］。Meta分析结果显示，TLR4中rs4986791基因变异会增加哮喘发生风险，且突变基因rs1927907可能与哮喘的严重程度有关。胸腺基质淋巴细胞（TSLP）由上皮细胞分泌，在气道重塑中起关键作用，TLR4的活化可以促进TLSP的生成，TLR4抑制剂则可通过抑制TLSP表达改善气道重塑［8］。随着中医的发展，中医在治疗各种疾病上具有独特的见解。CVA在中医学属于“久咳”“哮喘”等范畴。本病临床多见湿热郁肺证型，其主要病理特征为湿热郁痹，与现代医学CVA气道炎症、气道重塑可能存在必然的相关性［9-10］。而宣肺化湿止咳汤以清热化湿、宣肺止咳为主要功效，对湿热郁肺型CVA具有明显临床疗效［11］，宣肺化湿止咳在治疗湿热郁肺型CVA上是否通过影响TLR4信号通路而减轻其气道炎症及延缓其气道重塑。因此本文用豚鼠建立CVA模型，采用宣肺化湿止咳汤和孟鲁司特钠进行疗效比较，分析宣肺化湿止咳汤对TLR4信号通路影响CVA的作用机制，进一步为临床治疗CVA提供理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只清洁级豚鼠作为研究对象，均为雄性，平均年龄（3.84±0.42）周。体重90~110 g，平均体重（100.5±12.2）g。

1.2 主要药物

宣肺化湿止咳汤配方颗粒主要药物：炙麻黄10 g，连翘10 g，赤小豆30 g，枇杷叶10 g，蔻仁10 g，桑白皮15 g，桔梗10 g，前胡10 g，厚朴10 g，杏仁10 g，甘草6 g。以上中药均为颗粒剂（广东一方制药有限公司）。孟鲁司特钠片（顺尔宁，杭州默沙东制有限公司，批号17047，10 mg）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组方法 将60只豚鼠经适应性饲养1周，观察呼吸次数、体重、进食水量等基础生命体征无明显差异，按随机数字表法分为4组，包括空白组、模型组、宣肺化湿止咳汤组、孟鲁司特钠组，各15只。

1.3.2 造模方法 本造模方法参考咳嗽变异性哮喘的造模方式［12］，采用经典的卵蛋白（OVA）和氢氧化铝激发致敏并用OVA激发的方法复制CVA模型豚鼠。正常饲养3 d后开始实验，除空白组外，其余各组均在第1、8天每只豚鼠腹腔注射10%OVA和氢氧化铝混合溶液1 mL致敏。从第15天起，模型组及各给药组豚鼠置于密闭有机玻璃罩内，给予含1% OVA溶液的生理盐水超声雾化激发2 min，每天1次，共10 d。激发时观察豚鼠反应，如出现咳嗽、竖毛、喷嚏、干呕、腹肌抽动、极度烦躁等现象中2种或2种以上者，或抽搐、虚脱现象之一者，判定为造模成功。

1.3.3 模型制备 将咳嗽变异性哮喘病的造模方法与湿热证的造模方法相结合进行咳嗽变异性哮喘湿热证模型制备。

第l天、第8天：每只腹腔注射OVA溶液1 mL/次。第8天OVA致敏后开始放入人工气候箱中，温度（32.0±0.5）℃，相对湿度（90±5）%，每天造模时间为8∶00—12∶00和13∶00—17∶00，连续1周。

第15天开始1% OVA溶液雾化，30 min/（次·只）。第16天开始湿热环境暴露改为4 h（13∶00—17∶00）。雾化与湿热环境暴露交替进行，均隔日1次，连续4周，全程高脂高蛋白饲料喂养。

高脂高蛋白饲料配方：普通鼠类饲料65%，猪油15%，鸡蛋10%，全脂奶粉5%，蔗糖3%，芝麻油1%，食盐0.8%，猪胆盐0.2%。

模型鉴定方法：豚鼠在激发后出现咳嗽、挠鼻、伸颈、口周发绀、行动迟缓等症状，并有湿热证的表现，如嗜卧、行动呆滞、饮水少、便溏臭秽、小便黄、舌质红、苔黄腻等，则为造模成功。

1.4 给药方法

造模成功后，空白组、模型组予以同等剂量生理盐水。孟鲁司特钠组按孟鲁司特钠0.01 mg/（g·d），制成混悬液灌胃，4 ℃保存。宣肺化湿止咳汤组取颗粒加蒸馏水分别配制成浓度为0.74、1.48、2.22 g/mL的溶液灌胃。每日1次，连续10 d，给药剂量均为0.17 mL/（g·d）。

1.5 取材方法

治疗结束后，先将大鼠禁食（可自由饮水）24 h，称量各组大鼠体质量，用10%的水合氯醛按照300 mg/kg麻醉实验动物，在颈部及前胸部通过正中切口暴露气管及脏、肺，分离气管，并剪取100 mg气管，用以做气管羟脯氨酸测定。结扎右主支气管后，左肺行支气管肺泡灌洗术，分2次进行，分别灌入0.9% NaCl 3、4 mL，共计7 mL。每次灌注完毕，轻揉肺叶1~2 min，再回收支气管肺泡灌洗液（BALF），将2次收集的BALF均匀混合，回收液以1 500 r/min离心5 min，取上清液，-20 ℃贮存待检测。

1.6 细胞的分类及计数检测

末次雾化结束24 h后，用10%的水合氯醛按照300 mg/kg麻醉实验动物，在颈部及前胸部通过正中切口暴露气管及脏、肺，分离气管，并剪取100 mg气管，用以做气管羟脯氨酸测定。每只豚鼠收集BALF 10 mL离心，沉淀物涂片固定。取右肺中叶在浸泡于4%多聚甲醛室温固定，用以HE染色、Masson染色等。

1.7 气道重塑相关指标测量

Masson染色并采用Image- Pro Plus图像分析软件测量气道胶原沉积的面积，同时测气道壁相关数值。

1.8 蛋白免疫印迹法检测肺组织TLR4、NF-κB的表达

取豚鼠肺组织100 mg提取总蛋白后，经电泳转膜封闭后，豚鼠PPAR-γ、TLR4、NF-κB、NLRP3 ADPN一抗孵育，采用HRP标记的二抗，以ECL发光液显色，采用Alphaease FC软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.9 观察指标

（1）观察4组豚鼠肺泡灌洗液中细胞的分类及计数。（2）观察4组豚鼠气道重塑相关指标，包括支气管基底膜周长（Pbm）、内壁面积（WAi）以及气道平滑肌面积（WAm）水平。测得数据采用Pbm进行标准化，反映气道重塑程度。（3）观察4组豚鼠肺组织TLR4、NF-κB的表达水平。

1.10 统计学方法

实验所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行处理，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐用Welch法近似方差分析。两两比较方差齐用LSD法，方差不齐用Games- Howell法检验。非正态分布、方差不齐者组间比较采用非参数Kruskal-1i检验，两两比较采用All Pairwise检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺泡灌洗液中细胞的分类及计数比较

与空白组比较，模型组、鲁司特钠组、宣肺化湿止咳汤组肺泡灌洗液中各细胞计数明显升高（P<0.05）；与模型组比较，宣肺化湿止咳汤组和孟鲁司特钠组各细胞计数明显降低（P<0.05）；而宣肺化湿止咳汤组与孟鲁司特钠组各细胞计数比较无显著差异（P>0.05）。见表1。

表1 4组豚鼠肺泡灌洗液中细胞的分类及计数比较（n=15） ×108/L

2.2 气道重塑相关指标比较

与空白组比较，模型组、鲁司特钠组、宣肺化湿止咳汤组WAi/Pbm、WAm/Pbm水平明显增大（P<0.05）；与模型组比较，宣肺化湿止咳汤组和孟鲁司特钠组WAi/Pbm、WAm/Pbm水平均显著降低，且宣肺化湿止咳汤组低于孟鲁司特钠组（P<0.05）。见表2。

表2 4组豚鼠气道重塑相关指标比较（n=15）

2.3 肺组织TLR4、NF-κB表达水平比较

与空白组比较，模型组、鲁司特钠组、宣肺化湿止咳汤组TLR4、NF-κB表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组比较，宣肺化湿止咳汤组和孟鲁司特钠组TLR4、NF-κB表达水平均显著下降，且宣肺化湿止咳汤组低于孟鲁司特钠组（P<0.05）。见表3。

表3 4组豚鼠肺组织TLR4、NF-κB表达水平比较（n=15）

3 讨论

CVA是以咳嗽为唯一或主要症状的一种特殊类型的哮喘［13］。CVA患者大多数无喘息、气急等特征，但可存在气道高反应性。32%~54%的CVA患者可发展为典型哮喘，提示CVA可能是支气管哮喘的早期，与哮喘存在相同的发病机制［14］。CVA是我国慢性咳嗽最常见的病因，其发病率有所增加［15-16］。随着对咳嗽变异性哮喘病理生理的进一步研究，国内外专家发现CVA患者存在不同程度的气道重塑。咳嗽变异性哮喘与典型哮喘具有相同的发病机制与病理生理特点。气道重塑不仅是CVA持续性气道高反应性、不可逆性气道阻塞的重要病理基础，而且是CVA迁延难愈的主要原因［17-18］。研究表明，CVA的发病机制多从气道重塑、气道高反应性、气道炎症、喘息阈值改变等方面论述［19］。其中，以嗜酸性粒细胞浸润为主的气道炎性反应及相关形态重塑是影响CVA发生发展的关键机制［20］。

中医学认为湿热郁肺为CVA发病的重要病因，湿热郁肺之证，湿热在肺，肺气郁遏，仅靠宣肺恐难以对此类咳嗽起效。该病湿热郁滞，肺失宣降的病理特征与现代医学中CVA气道炎症、气道重塑可能存在必然的相关性。在湿热治疗方面，根据湿热郁闭肺气、肺失宣降的病机，提出宣肺与化湿二法相结合，可使湿热除、气道畅，肺气方得宣降复常，而咳嗽自愈。宣肺化湿止咳汤是课题组广泛应用于CVA湿热郁肺证患者治疗的经验方，疗效显著。该方由麻黄连翘赤小豆汤加减而成，可达到宣肺化湿、疏通气道之效［21］。“湿热郁肺”与CVA气道炎症、气道重塑存在必然的相关性，宣肺化湿止咳汤可能是防治CVA有效途径。因此本文采用豚鼠建立CVA模型，采用宣肺化湿止咳汤进行治疗，并采用孟鲁司特钠进行比较，分析对CVA的治疗效果。在本研究结果中，采用宣肺化湿止咳汤和孟鲁司特钠对于肺泡灌洗液中的中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞以及细胞总数均可降低，提示宣肺化湿止咳汤和孟鲁司特钠均能有效抑制豚鼠CVA模型的气道炎症，从而减轻CVA豚鼠模型的病情。气道重塑是目前临床认为CVA存在的主要变化，不仅是CVA持续性气道高反应性、不可逆性气道阻塞的重要病理基础，而且是CVA迁延难愈的主要原因［22］。在本文研究中发现，宣肺化湿止咳汤组和孟鲁司特钠组WAi/Pbm、WAm/Pbm水平均显著降低，且宣肺化湿止咳汤组低于孟鲁司特钠组。结果提示，宣肺化湿止咳汤有利于改善CVA豚鼠模型的气道重塑症状，抑制气道重塑的发生。由于宣肺化湿止咳汤中炙麻黄能发汗解表、宣肺平喘；连翘能清热解毒，疏风去邪；赤小豆能利水消肿、解毒排脓；枇杷叶能清肺止咳；前胡能解表退热；甘草理气和中、调和诸药。全方起到宣肺化湿、疏通气道之效，对咳嗽变异性哮喘具有良好治疗效果。

TLR4与哮喘的发生有密切关系，有学者研究表明，TLR4上的rs4986791基因突变，增加哮喘发生的风险，而rs1927907基因突变则与哮喘的严重程度有关［23］。PM2.5被人体吸入气道后，激活TLRs通路，诱导哮喘的发作。TLR4能促进胸腺基质淋巴细胞的分泌，从而加重气道的炎症反应。NF-κB目前也被认为与哮喘的发生和发展有密切关系，NF-κB位于TLRs下游信号通路，可以被TLR4激活，介导炎症反应的发生［24］。在观察4组患者细胞因子的TLR4、NF-κB蛋白表达时发现，宣肺化湿止咳汤组和孟鲁司特钠组TLR4、NF-κB均显著下降，且宣肺化湿止咳汤组低于孟鲁司特钠组。结果表明，宣肺化湿止咳汤能有效降低TLR4、NF-κB蛋白水平。

综上所述，宣肺化湿止咳汤可能通过下调肺组织中TLR4水平，从而有效调控咳嗽变异性哮喘的临床症状，改善CVA模型豚鼠的细胞因子水平，减轻气道重塑。