猪瘟疫苗的研究现状与发展趋势

贾华强

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪瘟是由猪瘟病毒感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是发病急、高热稽留和细小血管壁变性，从而引起泛发性小点状出血、梗死和坏死。该病传染性强，病死率高，对养猪业危害巨大。OIE 将其列为法定报告疾病，我国将其列为一类动物疫病。猪瘟病毒是其病原体，尽管猪瘟病毒各个毒株的毒力不同，但是它们都使养猪业产生了巨大损失，威胁着全世界的猪肉生产和国家人口的粮食安全。它在亚洲、中美洲和南美洲的一些地区以及许多东欧国家流行，在西欧偶有发现。目前没有药物可以有效治疗猪瘟，疫苗接种和生物安全措施是预防和控制猪瘟的主要方法。

1 猪瘟疫苗的发展现状与面临的挑战

1.1 弱毒疫苗 20 世纪40 年代，世界多个国家进行猪瘟病毒的弱化研究，其中日本使用低温适应性豚鼠肾细胞获得GPE-弱毒株，法国使用低温适应性细胞获得Thiverval 毒株。中国兽药监察所与中国农业科学院哈尔滨兽医研究所联合使用猪瘟病毒石门系强毒在家兔连续传代获得具有更好稳定性、安全性和免疫原性的猪瘟兔化弱毒株C 株（Chinese strain）。该毒株生产的疫苗已成为国内外预防猪瘟最常用的疫苗，但使用血清学方法不能区分感染动物和接种疫苗的动物（Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA），因而阻碍猪瘟病毒的根除。由于这一限制，欧盟国家不允许给猪接种高保护效力的弱毒株“C”株或类似的减毒活疫苗。在生产过程中家兔脾淋苗、全乳兔苗对动物福利不友好，由于细胞源弱毒疫苗使用胎牛血清会出现外源病毒感染（牛病毒性腹泻病毒，BVDV 等）的情况，导致猪瘟疫苗免疫效价降低，增加疾病传播风险。

1.2 亚单位疫苗 重组DNA 技术的出现意味着外源基因可以被插入表达载体，由细胞表达基因编码的外源蛋白。研究人员可以根据需求选择使用酵母、细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及植物细胞表达蛋白。猪瘟亚单位疫苗在区分感染动物和疫苗接种动物以及安全性方面具有优势，是控制和根除猪瘟的有前途的疫苗。

与原核系统相比，重组杆状病毒表达系统表达出的目的蛋白质具有正确的空间结构和翻译后修饰（如蛋白质糖基化和二硫键形成），因此疫苗具有有效的免疫原性。2018 年研究人员发现通过杆状病毒系统表达的猪瘟E2 蛋白和猪IFN-γ 蛋白可以显著增强断奶仔猪特异性免疫应答。密码子的优化、启动子的选择（如多角体蛋白、p10、Hsp70）、信号肽的选择（如蜜蜂蜂毒肽信号肽、免疫球蛋白K信号肽）都对E2 蛋白的表达效率有影响。到目前为止，尚未报道来自天然可溶性E2 蛋白的信号肽的精确序列。E2 蛋白的分泌效率和免疫原性尚未得到很好的优化，并且疫苗生产成本较高。2020 年研究人员发现SPZJ 信号肽在可以增加至少50%E2 蛋白的生产率，并且显著提高其免疫原性。为了进一步降低疫苗成本，孙贺群等人使用蛹虫草表达猪瘟E2蛋白，Park 等人使用烟草组织表达猪瘟E2 蛋白。李天增等人探究水佐剂、双相佐剂、油包水佐剂增强亚单位疫苗免疫的效果，发现油包水佐剂（ISA 植物油佐剂）表现优异。Ze 等人利用自组装肽（mi3）开发出基于CSFV E2 的自组装纳米疫苗SP-E2-mi3 NPs，研究结果表明E2-mi3 NPs 可以显著改善体液免疫和细胞免疫。Yanmin 等人采用生物信息学方法设计优化了连接子（linker）连接E2、IFN-γ 基因，在HEK293T 细胞中表达融合蛋白E2-R2-PIFN，以提高CSFV E2 亚单位疫苗的免疫原性。

基于杆状病毒表达E2 的两种疫苗（拜耳公司的BAYOVAC CSF E2 和默沙东公司的Porcelis Pesti）已在欧洲实现商业化。2017 年，国内天康生物成功注册重组杆状病毒灭活疫苗（Rb-03 株），将CSFV E2 蛋白基因插入杆状病毒，使用重组杆状病毒感染昆虫细胞表达猪瘟E2 蛋白，2018 年投入使用。华中农业大学与各企业合作开发出重组杆状病毒亚单位疫苗（WH-09 株），该疫苗安全性好，稳定性强，于2020 年成功注册。

尽管已经开发了亚单位疫苗，但它们的免疫原性和保护作用不如传统的减毒活疫苗（如免疫起效晚，免疫效力低，不能阻断垂直传播），后续还需继续探究免疫一次就能达到很好免疫效果的方案。

1.3 核酸疫苗 核酸疫苗的研究需要找到病原微生物引发机体产生抗体的特定抗原，再将其抗原的基因克隆到质粒上制成疫苗，或将信使RNA 直接制成疫苗导入动物体内。核酸疫苗的生产经济且高效，它们可以引发MHC I 类、MHC II 类T 细胞免疫应答反应。

研究专家基于甲病毒开发了新一代动物细胞表达载体系统，该系统可广泛选择动物细胞宿主，效率高，使用方便，近年来有关甲病毒载体的研究在国内外都非常活跃。该系统可以消除使用裸DNA疫苗产生染色体整合等潜在威胁，提高了常规DNA疫苗的生物安全性，其中基于塞姆利基森林病毒（SemLiki forest virus,SFV）开发的载体pSCA1 已被用于HPV DNA 疫苗的开发。这表明SFV 复制子衍生的DNA 疫苗可以成为针对CSFV 感染的潜在标志疫苗，然而接种多种疫苗产生高保护效果的成本较高，因此核酸疫苗在实际应用中并不广泛。

一些研究人员发现，PCV2 会干扰CSFV 疫苗的免疫作用，CSFV 疫苗的保护效果会受PCV2 感染的影响，CSFV 和PCV 的合并感染明显增加了养猪业疾病防控的难度，因此Fuyu 等人选择甲病毒质粒pSCA1 作为CSFV E2、Erns 基因以及PCV2 Cap 和Rep 基因的载体，结果表明，重组质粒疫苗可以在体外表达E2、Erns、Cap 和Rep 蛋白，并在体内促进CSFV 和PCV2 抗体的产生。

核酸疫苗还需投入大量的人力进一步评估可行性、安全性和有效性，并提升核酸疫苗在大动物体内的免疫原性和抗体效价。同时我们还需要注意持续高水平表达外源抗原会对机体产生伤害（如自动免疫、超敏反应、过敏反应、产生免疫耐受）。

1.4 嵌合病毒活疫苗 减毒活疫苗具有几个明显的优势。它可以通过在宿主中复制，更准确地模拟自然感染状态、易于给药、提供机体更长久的免疫力、全面刺激机体的免疫反应（体液免疫、细胞免疫）。出于这些原因，科学家们开发了嵌合病毒活疫苗。大多数病毒载体研究都集中在较大DNA 病毒上，特别是痘病毒、疱疹病毒和腺病毒。疱疹病毒（如传染性牛鼻气管炎病毒、猫疱疹病毒和伪狂犬病病毒）和腺病毒（如犬、马、禽和黑猩猩腺病毒）也正在开发为载体。

李谱华等人将CSFV 的E2 基因插入鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV) 构建重组病毒FV282-CSFV-E2，通过免疫保护实验证明其保护率为75%。孙永科等人通过293 细胞包装携带猪瘟Erns 基因的腺病毒。2023 年，Dong 等人将CSFV LOM 株的E2 基因插入BVDV KD26 株的骨架中，制备了嵌合病毒活疫苗KD26-E2LOM。2015 年Suvaxyn CSF Marker，一种嵌合体病毒活疫苗修饰BVDV 使其表达CSFV E2 基因，获得欧盟批准。然而，Suvaxyn CSF Marker 仅被批准用于紧急疫苗接种。

BVDV/CSFV 嵌合体病毒活疫苗CP7-E2alf，使用CSFV 毒株Alfort/187 的E2 基因取代BVDV 毒株CP7 的E2 基因，并于2014 年在欧洲获得上市许可。韩国政府通过将BVDV 的Erns 基因插入CSFV毒株Flc-LOM 中开发了具有DIVA 功能的疫苗Flc-LOM-BErns，于2017 年在韩国获得上市许可，并于2020 年将使用Flc-LOM-BErns 作为政策实行。这两种疫苗经过多方面的检验，如毒株的遗传稳定性、安全性以及疗效，证明其与传统减毒活疫苗一样安全有效，但它们不能预防强毒株的垂直传播。

CSFV 与其他病毒如PRV（伪狂犬病病毒）、PCV2（猪圆环病毒2 型）和PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）的合并感染在东欧和亚洲的大多数猪肉生产国（包括中国）非常普遍。针对这种情况，Selvaraj 等人构建了三基因缺失（糖蛋白E、糖蛋白G 以及胸苷激酶基因）疫苗载体PRVtmv，在三个基因删除的位点分别插入CSFV E2 基因、CSFV Erns与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合基因、PCV2b Cap 基因。Yang 等人将经过氨基酸突变的全长E2 基因插入PRV 中，首次实现使用PRV 表达全长E2 基因，结果显示表达E2 全长基因的疫苗免疫效果要比表达截断E2 基因的疫苗免疫效果好。

由于CSFV 和BVDV 的抗原关系密切，交叉反应性抗体可能导致假阳性反应和DIVA 鉴别失败。为了开发更好的具有DIVA 特性的候选标记疫苗，有研究专家通过使用远缘瘟病毒的同源基因取代猪瘟病毒Erns 基因，构建嵌合病毒。

1.5 合成肽疫苗 1963 年，使用化学方法分离出的烟草花叶病毒的六肽片段与牛血清白蛋白（BSA）偶联可以引发兔产生抗体，科学家们发现肽具有成为疫苗潜力。1982 年，Bittle 等人使用动物口蹄疫病毒（FMDV）首次证明肽除了在体外具有中和活性外，还可在体内引发保护性免疫。合成肽疫苗是根据病原微生物基因序列合成含有抗原决定簇的肽段制成的疫苗，其安全性和稳定性高且经济，可分为单肽疫苗和多肽疫苗，具有良好的开发前景。

Qianru 等人发现了E2 蛋白表面结构域C 和结构域D 的边界处的新型线性表位（256CLIGNTTVKV HASDER271），200 μg/mL 的线性肽与抗猪瘟血清孵育可使其中和能力降低63%，为猪瘟新疫苗的设计和鉴别诊断提供了理想的候选肽。Xiaotian 等人发现331ATDRHSDYF339 肽段可显著抑制猪瘟感染，这个发现可用于设计能产生快速保护的新疫苗。

1.6 基因缺失疫苗 这种疫苗是将病毒基因组中与病毒毒力相关的基因敲除或突变从而获得弱毒株制成的基因缺失疫苗。这使疫苗有更全面的免疫原性，且弱毒株不易恢复毒力。

Lauren 等人验证他们实验室研发的双抗原标记减毒CSFV 活疫苗，该毒株FlagT4v 插入了合成表位Flag，并使单克隆抗体表位WH 303 发生突变。结果显示，FlagT4v 疫苗可在使用后第3 天产生免疫反应，但是该疫苗难以大规模推广。Nicolas 等人选择两个强毒株Alfort/187 和Eystrup，使用鼠的泛素基因替换二者的Npro 基因,成功构建稳定的弱毒株,并且两种弱毒株都可以保护机体免受致死剂量的猪瘟强毒攻击。猪瘟基因缺失疫苗还需引进PRV 疫苗的技术手段，为后续猪瘟基因缺失疫苗的研发提供帮助。

1.7 全长感染性cDNA 标记疫苗 全长感染性cDNA 标记疫苗是使用反向遗传学技术在分子水平上,将具有标记的基因替换到致弱病毒全长cDNA中,获得的重组病毒为DIVA 疫苗。Gil 等人经RT-PCR 得到可以代表CSFV LOM 基因组的8 个DNA 片段,构建具有8 个碱基突变的全长cDNA 克隆Flc-LOM。免疫动物14 d 后机体产生特异性中和抗体。该种类疫苗可以将标记性基因克隆到CSFV 弱毒cDNA 中，为建立快速、准确的CSFV 检测试剂盒奠定基础。

2 未来发展趋势

几十年以来，人们一直在使用安全有效的减毒活疫苗来控制猪瘟，为根除猪瘟铺平道路，虽然这些疫苗在免疫效果和免疫持续时间上具有突出的优势，但是它们不能区分感染动物和接种疫苗的动物。作为猪瘟第一代DIVA 疫苗，商业化的E2 亚单位疫苗具有高度的安全性，但是缺乏一定的功效，因此很多研究专家致力于开发下一代具有良好安全性、有效性和适销性的DIVA 疫苗。虽然目前很多新型疫苗的研发都处于实验室阶段，但随着人们不断地深入研究，将新型疫苗的优势最大化，DIVA 疫苗将在净化猪瘟上发挥巨大作用。