不同醇化时间对片烟原料附生细菌种群多样性及质量的影响

崔钰杰 邹克兴 陈义昌 刘领 王小东 梁伟

关键词：醇化时间：片烟原料：高通量测序：多样性分析：质量分析

烟草作为我国重要的农业经济作物，其栽种面积大，年产量高。我国既有庞大的烟草消费市场，又拥有着众多的吸食烟草群体。随着烟草质量的提升和生产技术的革新，吸食者对烟草的品质有了新的需求，如吸食过程中烟叶香味醇厚、吃味更好、青杂气减少等方面，“醇化”是业内公认的提升烟叶品质的关键环节。通过醇化，可使烟叶颜色逐渐加深并更加均匀，进而提升香气物质，使吸食味道醇和。烟叶醇化分为人工醇化和自然醇化两种，人工醇化速度快但醇化效果较差；自然醇化效果较好，但醇化周期长，烟叶长期与外界环境密切接触易导致霉变生虫。针对以上两种醇化方式存在的弊端，烟草研究者利用优势微生物对片烟进行醇化，既能提高醇化效果，又能够降解烟叶中的有害成分、提升烟叶品质，为烟草醇化提供了新的技术方式。

近年来，高通量基因测序技术已被广泛应用于多个研究领域，通过高通量测序能够快速筛选出烟叶中的优势微生物种群并对其进行一系列分析。基于此，本研究以广西百色、湖南郴州两地区分别醇化0、12、24、36个月的中部片烟（C3F）为试验材料，利用高通量基因测序技术对片烟原料进行附生细菌多样性分析和化学成分分析．筛选出优势菌群，从而可为片烟醇化复配微生物制剂提供物种信息，又可为烟叶最佳醇化时间的选择提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试片烟为广西百色（广西中烟工业有限责任公司提供）、湖南郴州产地的片烟原料，烟叶等级均为C3F。样品名称、烟叶产地等信息如表1所示。片烟贮存仓库温度32℃，湿度66%。

1.2样品采集

对广西百色、湖南郴州两地区分别醇化0、12、24、36个月的复烤片烟原料单独进行取样，每包片烟3个生物学重复，依次装至干燥无污染的塑封袋保存待测。

1.3高通量测序及分析

高通量测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成，测序获得ASV（Amplicon Sequence Va-riant）丰度信息，通过ASV代表序列丰度信息，利用美吉生物云平台（https：//www. majorbio. com）对其进行微生物群落多样性分析、差异分析、功能分析等。

1.4片烟化学质量分析

片烟化学质量采用AntarisⅡ傅立叶近红外光谱分析仪（赛默飞世尔科技公司，美国）进行分析。

2结果与分析

2.1不同醇化时间片烟原料细菌多样性分析

对广西百色、湖南郴州的片烟进行微生物多样性指数分析，按照最小抽平数进行抽平，覆盖率达到99%以上。由表2可以看出，YO片烟的群落丰富度（Sobs、Ace、Chao）指数和群落多样性（Shannon）指数都高于其他3个处理，Y2片烟的群落丰富度和群落多样性指数最低，表明YO片烟中微生物群落丰富度和多样性最高。

随机抽取样品测序数达26000，能较好地反映样本中的微生物多样性情况。如图1所示，Sobs指数和Shannon指数曲线均达到平稳，且均以YO处理最高；当随机抽取测序数达20000时，YO处理的Sobs指数最高，为350，其次是Y3，指数为215;YI指数为200，最低的为Y2，为155;当随机抽取测序数达到12000时．Shannon指数YO在四个样本中最高，达到4；Y1、Y3的指数分别为3.4、2.9，Y2的指数最低，为2.4。以上结论表明，YO片烟的微生物群落丰富度和多样性更高。

2.2不同醇化时间片烟原料细菌群落组成分析

不同醇化时间片烟原料细菌共鉴定出28个门、548个属。在门水平上（图2），变形菌门（Pro-teobacteria）的相对丰度最高，達到0.8以上，在广西百色和湖南郴州的样本中均为优势菌门，其次是厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteri-ota）。

在属水平上（图3），假单胞菌属（Pseudo-monas）在所有样本中相对丰度均较高，部分达到0.6左右，其次为未分类产菌科属（unclassified_f_Alcaligenaceae）、硫杆菌属（Thiobacillus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、黄色单胞菌属（Xan-thomonas）、代尔夫特属（Delftia）、水生微生物属（Aquamicrobium）；未分类伞形孢科属（unclassified_f_Xanthomonadaceae）、红球菌属（Esherichia-Shigel-la）、肠杆菌属（unclassified_f_Bacillaceae）、芽孢杆菌属（Noviherbaspirillum）相对丰度较低。以上结果表明广西百色和湖南郴州两地的片烟微生物群落组成较为相似，微生物群落较丰富。

不同醇化时间片烟原料细菌物种数Venn图见图4。在门水平上（图4A），四个处理共有的菌门数为11个，Y3处理特有菌门数最多，有6个，其次为Y1和Y2处理，分别有3个和2个，YO处理无特有菌门。在属水平上（图4B），4个处理共有的菌属数量为111个，其中Y3处理特有属数目最多，为97个，其次为YO和Y1处理，分别有60个和47个，Y2处理最少，为38个。结果表明，在不同的分类学水平下，每个处理特有类群的数量不同，表明试验样本微生物群落的多样性较高。

2.3不同醇化时间片烟原料细菌属水平差异分析

图5为属水平细菌物种差异比较分析，按最小抽平数抽平。其中，鞘氨醇单胞菌属、迪凯亚属（Diclceya）、马西利亚属（Massilia）3个菌属不同处理间呈显著性差异（P<0.05），Y0处理中上述3个属平均占比均最高，分别为7.41%、3.49%、1.21%；肠杆菌属（Enterobacter）和未分类的肠杆菌科（unclassified_f_Enterobacteriaceae）呈极显著差异（P<0.01），YO处理片烟样本中上述两个类群占比均最高，分别为4.28%、3.22%。

2.4不同醇化时间片烟原料微生物功能分析

采用FAPROTAX人工构建数据库对片烟样本微生物进行功能分析，共鉴定出21个功能分组。如图6所示，化学异养（chemoheterotrophy）、好氧化学异养（aerobic chemoheterotrophy）、暗氧化硫化合物（dark oxidation of sulfur compounds）、暗硫化物氧化（dark sulfide oxidation）、硝酸盐还原（nitrate reduction）、硝酸盐呼吸（nitrate respira-tion）、氮呼吸（nitrogen respiration）7个功能在所有样本中表达功能均较丰富；锰氧化（manganeseoxidation）、木聚糖分解（xylanolysis）、亚硝酸盐呼吸（nitrite respiration）、氮气固定（nitrogen-fixa-tion）4个功能偏弱但在所有试验样本中普遍存在。

微生物群落FAPROTAX功能差异检验（图7）显示，化学异养、好氧化学异养功能占比达到35%以上；暗氧化硫化合物、暗硫化物氧化、硝酸盐还原功能占比5%以上，其他功能在所有样品中也少量存在；发酵功能（fermentation）、动物寄生虫或共生体（animal parasites or symbionts）、人类肠道（human gut）、哺乳动物肠道（mammal gut）4个功能在各处里间呈极显著差异（P<0.01），Y0样本的占比最高，均在5%以上。所鉴定试验样品在功能上呈现多样性的态势，广西百色和湖南郴州两地区的片烟在微生物功能构成上也较为相似。

2.5不同醇化时间对片烟原料微生物化学质量的影响

表3可知，湖南郴州Y1处理片烟的总糖和还原糖含量均最高，分别为22.30%和19.70%，广西百色Y3的总糖和还原糖含量最高，分别为24.40%和21.30%；在烟碱含量中，湖南郴州Y2最高，Y1最低，分别为3.08%和2.21%，广西百色Y2最高，Y0最低，分别为为2.94%和为2.01%：在总氮含量中，湖南郴州Y2最高，Y1最低，分别为2.28%和1.90%，广西百色Y1最高，Y3最低，分别为2.16%和1.80%：在钾含量中，湖南郴州Y1最高，YO最低，分别为3.24%和2.95%，广西百色Y3最高，Y2最低，分别为3.14%和2.50%；在氯含量中，湖南郴州YO最高，Y3最低，分别为0.67%和0.49%，广西百色Y3最高，Y2最低，分别为0.61%和0.49%；在淀粉含量中，湖南郴州Y1最高，Y2最低，分别为4.22%和3.71%，廣西百色YO最高，Y2最低，分别为4.75%和3.42%。

上述结果表明，不同地区、不同醇化年限的片烟，附生微生物对烟叶化学品质产生了影响：随着醇化时间的延长，片烟内部微生物种群结构和功能发生变化，与烟叶的各个有机成分发生反应进而提升了相应化学成分的含量。

3讨论与结论

微生物通过一系列降解反应产生出有益的小分子物质，可以加快烟叶中有害成分的分解，进而改善烟叶品质，以达到增香的目的。本研究以广西百色、湖南郴州片烟原料为材料进行微生物多样性分析和化学质量分析，通过高通量基因测序得出两地片烟细菌物种非常丰富，且种群构成相似，这与牟丹等的研究结果一致：在门水平上主要以变形菌门、厚壁菌门、放线菌门为优势菌门，在属分类学水平主要以假单胞菌属、未分类产菌科属、硫杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、黄色单胞菌属、代尔夫特属、水生微生物属为优势菌属，这与Su、田丽君、周家喜等的研究结果一致。

醇化烟叶表面微生物可使烟叶内多种物质迅速发生分解、降解、氧化等反应，生成醇类、醛类、酮类、酸类和新植二烯等香气成分物质。除此之外，还有发酵功能、人体病原、动物寄生等类群，表明细菌通过多种途径获益于自身并作用于烟叶。广西百色、湖南郴州地区的片烟细菌微生物群落构成较复杂，其中化学异养功能在所有测试样本中占比均较高，有助于烟叶中有机质的降解；相对丰度较高的变形菌门、厚壁菌门、放线菌门及假单胞菌属、硫杆菌属、鞘氨醇单胞菌属等都可以降解有机物，这与赵铭钦等关于烤烟叶面增香机制的研究论述较为相似。目前，烟草微生物的应用大多集中在病虫害防治和有害成分降解等方面，在普洱茶、雪茄烟以及辣椒酱等发酵领域的研究也较多，如刘琨毅等研究表明，地衣芽孢杆菌与其他微生物协同作用对普洱茶的感官品质有一定的提升作用：刘颖等对韶关和衡阳地区自然发酵辣椒的研究显示，厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，假单胞菌属和泛菌属为优势菌属，功能以代谢为主，包括碳水化合物代谢、脂质代谢、核苷酸代谢等；叶长文等研究发现雪茄烟中优势菌门为厚壁菌门和子囊菌门，优势菌属为葡萄球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和曲霉属；刘筱雪等以四川怀远特色发酵食品为材料研究发现，厚壁菌门和子囊菌门为优势菌门，这可能与当地气候产生大量的有益微生物有一定的关系。本研究还发现，鞘氨醇单胞菌属和肠杆菌属在功能性上作用更加突出，其中，鞘氨醇单胞菌属在生物降解和生物质合成方面发挥着重要作用，在环境、农业、食品及工业生产等诸多领域具有广泛的市场应用价值：肠杆菌属为革兰氏阴性益生菌，因其对肠道疾病有显著的缓解效果而被广泛用到临床治疗中，可以有效预防和治疗由病原菌引起的胃肠道疾病，如炎症性肠病（IBD），起到调节动物胃肠道稳定和体内平衡的作用。此外，对片烟化学质量的分析结果显示，随着醇化时间的延长，片烟附生优势菌群没有失活反而可能与有机成分发生反应，提升烟叶质量，这与黄申、胡婉蓉、杨丽平等利用微生物菌剂或单一微生物作用于烟叶提升品质的研究结果基本一致。

综上，广西百色、湖南郴州两地区片烟原料细菌物种丰富，菌群组成相似，变形菌门、厚壁菌门、放线菌门为优势菌门；假单胞菌属、未分类产菌科属、硫杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、黄色单胞菌属、代尔夫特属、水生微生物属为优势菌属。物种差异分析和功能分析均呈现显著差异。在片烟化学质量分析中得出，随着醇化时间的延长微生物菌种不断地和有机成分发生反应进而使烟叶成分得到了优化提升。该研究结果可为进一步选用优势菌群复配微生物制剂提供物种信息，为片烟最佳醇化时间的选择提供依据。