miR-21低表达对垂体瘤细胞系RC-4BC增殖、凋亡的影响及与PTEN靶向关系

宋志远，任洪波，韩晓正，牛国栋

邯郸市中心医院神经外三科，河北 邯郸 056009

垂体瘤是仅次于脑膜瘤和神经胶质瘤的第三常见颅内肿瘤，占所有颅内肿瘤的10%～15%［1］。尽管大多数垂体瘤是良性和生长缓慢的恶性肿瘤，但患者可能会出现严重的头痛、视觉问题和激素相关症状［2］。一些垂体瘤具有侵袭性，可导致严重的症状甚至死亡。垂体瘤发生发展的病因和机制尚不清楚，阐明垂体瘤的发生发展的潜在分子机制有助于其早期发现、治疗和改善患者的预后。微小RNA（miRNA）是一类17～27个核苷酸组成的单链非编码小分子RNA，miRNA作为机体内在调节因子，参与包括细胞增殖、分化和凋亡等一些系列细胞生理过程。越来越多的研究［3］表明，miRNA可以通过与靶基因的3′非翻译区（3′UTR）特异性结合来调节靶基因的表达。研究［4］显示，垂体瘤中miRNA的异常失调可能参与垂体瘤的发生发展。miR-21是近年来发现的与细胞增殖分化有关的miRNA家族成员。既往研究［5-6］发现，miR-21在垂体瘤组织细胞和血浆中表达异常升高，并且与垂体瘤的侵袭性相关，但miR-21对垂体瘤细胞增殖、凋亡的影响及机制尚不明确。第10号染色体丢失的张力蛋白同源磷酸酶基因（PTEN）是目前研究较多的公认的抑癌基因之一，既往研究［7-8］显示miR-21能靶向PTEN参与包括肿瘤细胞在内的机体细胞功能的调控。2022年2月—2022年10月，我们观察了miR-21低表达对垂体瘤细胞系RC-4BC增殖、凋亡的影响，并分析其与PTEN的靶向关系。

1 材料与方法

1.1 细胞系和试剂 人垂体瘤细胞系RC-4BC购自美国典型培养物保藏中心。总RNA提取试剂TRIzol购自北京天根公司；PCR引物、脂质体Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒和RT-PCR荧光定量试剂盒购自大连宝生物公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自北京达科为公司；miR-21模拟物miR-21 mimics、模拟物阴性对照NC-mimics、miR-21抑制物miR-21 inhibitor、抑制物阴性对照NC-inhibitor、野生型PTEN荧光素酶报告基因质粒PTEN-WT、突变型PTEN荧光素酶报告基因质粒PTEN-MUT购自上海吉玛制药公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博公司。

1.2 细胞培养、转染及分组 RC-4BC细胞置于RPMI-1640培养基（含10% FBS），在5%二氧化碳、37℃恒温环境中培养，2～3 d更换培养基一次。转染操作时，取对数生长期的RC-4BC细胞接种于12孔细胞板，按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作分别将miR-21抑制物miR-21 inhibitor、抑制物阴性对照NC-inhibitor转染至RC-4BC细胞，转染后细胞标记为两组：沉默组（转染miR-21 inhibitor）和阴性对照组（转染 NC-inhibitor），转染后12 h更换新鲜培养基，24 h后收集细胞用于后续实验。

1.3 两组细胞中miR-21、PTEN mRNA检测 采用RT-PCR法。TRIzol试剂提取两组细胞总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的纯度和浓度合格。取总RNA逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，加入PCR引物，应用RT-PCR荧光定量试剂盒配置反应体系，进行进行荧光定量PCR扩增反应。PCR引物序列：miR-21正向引物为5′-GCCGCTAGCTTATCAGACT-3′，反向引物为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；U6正向引物为5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；PTEN正向引物为5′-AAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATC-3′，反向引物为5′-AAAACAGTAGAGGAGCCGTCAAATC-3′；GAPDH正向引物为5′-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3′，反向引物为5′-CTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。PCR反应条件如下：95 ℃ 2 min，40个循环（95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s）。miR-21以U6作为内参基因，PTEN以GAPDH作为内参基因，以2-ΔΔCt表示细胞中受检基因mRNA的相对表达量。

1.4 两组细胞增殖能力观察 采用CCK8实验。取两组RC-4BC细胞，采用胰酶消化后制备单细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/ml，以每孔100 μL接种于96孔细胞板中，继续培养24、48、72 h时向每孔加入10 μL CCK溶液，在37 ℃继续孵育2 h，于酶联免疫检测仪检测各孔波长490 nm的OD值，以OD值表示细胞增殖能力。

1.5 两组细胞集落形成能力观察 采用平板克隆实验。取两组RC-4BC细胞，采用胰酶消化后制备单细胞悬液，以每个培养皿200个细胞的密度接种到含10 mL培养液的细胞培养皿中，在5%二氧化碳、37 ℃的恒温环境中孵育14 d后，肉眼可见细胞集落，吸弃培养液，PBS洗涤2遍，加入4%多聚甲醛固定细胞，染色细胞20 min，去除染色液，室温下干燥，显微镜下计数集落形成数，以大于50个细胞的集落表示为一个克隆细胞数。

1.6 两组细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取两组RC-4BC细胞，胰蛋白酶消化后，PBS洗涤3遍，加入结合液500 μL重悬细胞，避光加入Annexin V-FITC 5 μL混匀，再加入PI 5 μL，充分混匀后，室温孵育15 min，立即上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 两组细胞周期分布情况观察 采用流式细胞术。取两组RC-4BC细胞，PBS洗涤2遍，加体积分数70%的预冷乙醇固定，4 ℃固定24 h后，1000 r/min离心5 min分离乙醇，去上清，PBS洗涤3遍，加适量RNaseA，37 ℃水浴30 min后加入适量PI混匀，4 ℃避光染色30 min，最后上流式细胞仪检测G0/G1期、S期细胞占比。

1.8 miR-21与PTEN的靶向关系验证 采用双荧光素酶报告基因实验。收集RC-4BC细胞制备单细胞悬液，接种于12孔板，按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂说明书操作分别将miR-21 mimics或NC-mimics与PTEN-WT或PTEN-MUT共转染至RC-4BC细胞，转染后细胞标记为四组：miR-21 mimics+PTEN-WT组、NC-mimics+PTEN-WT组、miR-21 mimics+PTEN-MUT组、NC-mimics+PTEN-MUT组。转染24 h后收集并裂解各组细胞，应用荧光素酶检测试剂盒检测相对荧光素酶活性。

1.9 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析检验，两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量比较 沉默组RC-4BC细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量分别为0.30 ± 0.08、2.89 ± 0.14，阴性对照组RC-4BC细胞中miR-21、PTEN mRNA相对表达量分别为1.01 ± 0.02、0.99 ± 0.03，两组相比，P均＜0.05。

2.2 两组细胞增殖能力比较 沉默组RC-4BC细胞24 h、48 h、72 h时OD值分别为0.40 ± 0.11、0.77 ±0.13、1.51 ± 0.15，阴性对照组RC-4BC细胞24 h、48 h、72 h时OD值分别为0.69 ± 0.08、1.50 ± 0.18、2.81 ± 0.26，两组相比，P均＜0.05。

2.3 两组细胞集落形成数目比较 沉默组RC-4BC细胞集落形成数为（108 ± 18）个，阴性对照组RC-4BC细胞集落形成数目为（215 ± 29）个，两组相比，P＜0.05。

2.4 两组细胞凋亡率比较 沉默组RC-4BC细胞凋亡率为22.30% ± 5.64%，阴性对照组RC-4BC细胞凋亡率为5.59% ± 2.08%，两组相比，P＜0.05。

2.5 两组细胞周期分布情况比较 沉默组RC-4BC细胞G0/G1期占比65.65% ± 7.82%、S期占比19.25% ± 3.70%，阴性对照组RC-4BC细胞G0/G1期占比45.62% ± 5.03%、S期占比35.72% ± 4.67%，两组相比，P均＜0.05。

2.6 miR-21与PTEN的靶向关系验证结果miR-21 mimics+PTEN-WT组、NC-mimics+PTEN-WT组、miR-21 mimics+PTEN-MUT组、NC-mimics+PTEN-MUT组细胞的相对荧光素酶活性分别为0.39 ± 0.07、1.02 ± 0.03、1.01 ± 0.04、1.00 ±0.03，其中miR-21 mimics+PTEN-WT组相对荧光素酶活性与其他各组相比，P均＜0.05，提示miR-21的靶基因是PTEN。

3 讨论

垂体瘤是常见颅内肿瘤之一，影响患者的生长发育、生殖、学习和工作能力。由于其复杂的发病机制，垂体瘤的治疗是一个临床难题。目前垂体瘤的治疗通常包括手术、药物和放射治疗，这些治疗方法的目的是减少或消除肿瘤占位性病变的影响，纠正肿瘤分泌过多的激素，并保持正常的垂体功能。然而，垂体瘤手术后的复发率很高，还可能会导致尿崩症、脑脊液渗漏、视力障碍恶化和脑瘫等手术后并发症。因此，探索调控垂体瘤细胞生长的基因通路，开发新的有效治疗方法很重要。

miRNA是一种内源性非编码小分子RNA，在各种疾病的发生和发展过程中发挥着重要作用。随着测序技术的发展，已经发现了大量的miRNA与肿瘤细胞的生长有关。miRNA被认为有望成为诊断和治疗各种疾病的新靶点。2005年BOTTONI等［9］人首次研究并报道了垂体瘤和miRNA之间的相关性，发现miR-15a和miR-16-1在垂体瘤中的表达水平较正常垂体组织低。近年来相继研究［10］发现许多miRNA可能与垂体瘤的发生发展有关，但目前研究尚没有发现在垂体瘤发生进展中起关键作用的miRNA。miR-21是近年来发现的与细胞生长、发育和衰老等生命过程有关的miRNA家族成员之一，在肿瘤的生长中可能起着重要作用［11］。在肿瘤细胞的研究［12］显示，miR-21在大多数肿瘤中表达上调，具有促进肿瘤细胞生长及转移的高致癌特性，并且与肿瘤的化疗耐药有关。近期AMARAL等［5］发现，垂体瘤手术样本中miR-21的表达明显高于从尸检中获得正常垂体组织标本。郝良超等［6］还发现，在侵袭性垂体瘤患者瘤组织和血浆中miR-21的表达水平明显高于非侵袭性垂体瘤患者。但目前有关miR-21在垂体瘤中的研究仍较少，并且其作用机制并不明确。为了探讨miR-21在垂体瘤发生发展中的可能的作用机制，本研究通过脂质体转染技术，成功沉默了miR-21表达水平最高的垂体瘤细胞系RC-4BC细胞中miR-21的表达水平，通过CCK-8实验、平板克隆实验、流式细胞术等实验介绍发现，沉默miR-21表达的RC-4BC细胞，24、48、72 h时OD值明显下降，集落形成能力明显降低，细胞凋亡率、细胞周期G0/G1占比明显升高，S期占比明显下降，说明沉默miR-21表达能够抑制垂体瘤细胞的增殖，并促进其细胞凋亡。

通过调控下游靶基因的转录或翻译，从而影响靶基因的功能，是目前发现的miRNA调控的主要机制。PTEN位于人染色体10q23.31染色体上，是目前研究较多的公认的抑癌基因之一，PTEN通过不同的机制发挥着调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、转移等多个过程［13］。目前有关PTEN在垂体瘤中的研究较多，研究［14-16］发现垂体瘤组织中PTEN的表达明显降低，并且与垂体瘤的侵袭性相关。大量的研究［17-20］已经证实，过表达垂体瘤细胞中PTEN基因，可显著抑制瘤细胞的增殖及迁移侵袭能力，并能够促进瘤细胞的凋亡。本研究中，我们通过RT-PCR检测发现，沉默miR-21表达的垂体瘤细胞中PTEN mRNA的表达明显升高，双荧光素酶报告基因显示miR-21能够靶向PTEN基因从而影响荧光素酶活性，提示沉默miR-21表达对垂体瘤细胞生长的影响可能与其对PTEN基因的靶向调控有关。

综上所述，沉默miR-21能够抑制垂体瘤细胞增殖活性及集落形成能力，将细胞周期阻滞于G0/G1期，并诱导其凋亡，其机制可能与其对PTEN基因的靶向调控有关，为垂体瘤的治疗提供了新的研究思路。