玉米秸秆降解复合菌系的筛选及发酵产短链脂肪酸

汪文君 刘国庆 王志花

汪文君，刘国庆，王志花. 玉米秸秆降解复合菌系的筛选及发酵产短链脂肪酸［J］. 湖北农业科学，2024，63（2）：55-58．

摘要：利用筛选得到的复合菌系来发酵玉米秸秆，研究复合菌系对降解秸秆产短链脂肪酸的影响，并对微生物菌群结构组成进行解析。结果表明，复合菌系在前4 d的降解速度最快，秸秆、纤维素和木质素的降解率分别达30.35%、27.07%和14.71%，在12 d时，其降解率分别达40.02%、32.25%和20.93%。复合菌系的代谢产物以异丁酸和乙酸为主，其含量分别占总短链脂肪酸的36.46%和33.15%。由高通量测序可知，复合菌系中的优势菌属主要由Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等组成。

关键词：玉米秸秆； 复合菌； 筛选； 降解； 短链脂肪酸

中图分类号：Q939.9         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）02-0055-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.02.010 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening of maize stover degradation complex strains and fermentation to produce short-chain fatty acids

WANG Wen-jun， LIU Guo-qing， WANG Zhi-hua

（School of Food and Biological Engineering， Hefei University of Technology， Hefei  230601，China）

Abstract： The compound strains obtained by screening were used to ferment corn straw， the effects of the compound strains on degrading straw to produce short-chain fatty acids were studied， and the structural composition of the microbial consortium was analyzed. The results showed that the degradation rate of the compound strain was the fastest in the first 4 days. The degradation rates of straw， cellulose and lignin reached 30.35%， 27.07% and 14.71%， respectively. At 12 days， the degradation rates reached 40.02%， 32.25% and 20.93%， respectively. The metabolites of the compound strain were isobutyric acid and acetic acid， which accounted for 36.46% and 33.15% of the total short chain fatty acids， respectively. According to high-throughput sequencing， the dominant bacteria genera in the compound strains were mainly composed of Clostridium sensu stricto， Cellulosilyticum， Clostridium XIVa， Enterobacteriaceae and Peptostreptococcaceae.

Key words： corn straw； compound bacteria； screening； degradation； short chain fatty acids

中国是农业生产大国，农作物秸秆种类繁多，占国内生物质资源总量的50%以上^［1］。以水稻、小麦和玉米秸秆为主，其中，36.7%为玉米秸秆，在所有秸秆中占最大部分，这可能与中国大部分地区主要农作物是玉米相关^［2］。纤维素、半纤维素以及木质素含有极为丰富的碳元素、较低的氧含量，故其能量密度较高，是玉米秸秆的主要组成成分，若能将其合理并高效利用，将是一种极好的生物能源^［3］。因此如何提高秸秆的综合利用率成为全社会关注的热点问题。

厌氧发酵是秸秆等农业废弃物高值化利用的有效技术手段，该方法的实质是厌氧微生物将有机废弃物降解为低分子量化合物，在發酵过程中获得沼气等可燃性能源气体以及富含有效营养物质和稳定腐殖质的产品^［4，5］。但秸秆产沼气工艺存在降解率低、降解周期长及成本投资高等缺陷^［6-8］。而秸秆厌氧发酵产短链脂肪酸（Short-chain fatty acids， SCFAs）工艺，因其发酵周期短、经济效益高等显著优势成为极具前景的新型高值化利用方向^［9］。SCFAs是一种由6个或6个以下碳原子组成的短链单羧酸。常见的SCFAs有乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和丁酸乙酯等^［10］。在厌氧发酵过程中，添加甲烷菌抑制剂可使得产甲烷菌停止作用，SCFAs则无法被转换为甲烷，从而可获得高浓度的SCFAs^［11］。这些酸具有广泛的应用，如生产醇、醚等化工原料，替代不可再生的化石资源^［12］。此外，有研究报道SCFAs在维持人类健康方面具有非常特定的功能，影响各种疾病的发展、预防和治疗^［13］。

本研究从污泥中筛选得到能高效降解玉米秸秆的复合菌系，通过高通量测序，明确该复合菌系的优势菌属组成，同时对其发酵产物即短链脂肪酸进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米秸秆取自安徽省阜阳市农场，烘干粉碎后过30目筛网，密封常温保存。

复合菌系是由合肥工业大学食品与生物工程学院实验室从污泥中筛选得到。

1.2 方法

1.2.1 培养基

1）富集培养基：氯化铵1 g/L、磷酸氢二钾0.4 g/L、磷酸二氢钾0.4 g/L、氯化镁1 g/L、酵母膏1 g/L，指示剂为刃天青和L-半胱氨酸，培养基的pH为7.0～7.2。

2）厌氧产酸菌培养基：氯化铵1 g/L、氯化镁1 g/L、磷酸二氢钾0.4 g/L、酵母膏1 g/L、氯化钠1 g/L、葡萄糖8 g/L，溴甲酚紫指示剂5 mL，指示剂为刃天青和L-半胱氨酸（培养基的pH为7.0～7.2）。

3）发酵培养基：氯化钠5 g/L、氯化铵1 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏提取物1 g/L、碳酸钙2 g/L。

1.2.2 富集 厌氧瓶预先分装0.5%（m/V）滤纸条，通氮气排空厌氧瓶的氧气。预加900 mL去离子水于1 L的三角瓶中，称取富集培养基组分并依次溶解，调pH至7左右，补去离子水至1 L并加热煮沸，直到刃天青的颜色消失，再接着煮沸5 min，最后分装到厌氧瓶中，121 ℃高温灭菌30 min，每个厌氧瓶中分装50 mL培养基，接种量为10%，35 ℃静置培养。待滤纸开始降解时，转接到新鲜的培养基中继续富集，将连续富集3次之后的培养物用于进一步筛选。

1.2.3 复合菌系的筛选 参考张鑫等^［14］的研究方法，筛选能够降解玉米秸秆的复合菌系。在50 mL培养基中接种富集培养液，并加入5 g秸秆作为碳源，瓶内放入1片滤纸条作为分解的外观指标，35 ℃静置培养。当瓶内滤纸条降解，秸秆发生软化时取2.5 mL培养液作为种子接种到同样的新鲜培养基中。如此转接数代，逐渐淘汰分解速率慢的培养物，留下具有较强分解能力的培养物继续培养。等留下的培养物到10代以上仍然具有较好的分解能力时，选择具有高分解能力的培养物，进行发酵试验。

1.3 试验设计

称取30 g玉米秸秆，置于1%氢氧化钠溶液中浸泡24 h，之后用去离子水对秸秆反复冲洗直至pH接近中性，然后置于80 ℃的鼓风干燥箱中进行干燥以用于厌氧产酸发酵，发酵周期为12 d。为抑制甲烷的产生，在发酵起始阶段添加一定的碘仿乙醇溶液作为甲烷抑制剂。

1.4 指标测定

采用滤网过滤产酸发酵液测定玉米秸秆降解率，将残留物于85 ℃烘干并称质量，用减质量法计算出秸秆降解率^［15］，采用比色法^［16］測定纤维素降解率，采用普鲁士法^［17］测定木质素的降解率。采用pH计（PHS-3C型）测定pH，短链脂肪酸采用GC-MS（QP2010 Plus型）测定。秸秆降解率、pH和短链脂肪酸每2 d测定1次。

1.5 微生物多样性的测定

为探究复合菌系微生物组成，分析降解木质纤维素的微生物，采用高通量测序方法进行微生物多样性的测定。取3个平行样品，将样品以13 000 r/min离心5 min，弃上清液，剩余沉淀物按照试剂盒（OMEGA E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒）说明书进行DNA提取。将检测合格的DNA样品采用16S V3-V4引物进行第一轮PCR扩增。PCR反应体系：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、Bar-PCR primer F 1 μL、Primer R 1 μL、PCR products 10～20 ng、ddH2O 9～12 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，预循环5次；94 ℃退火20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环20次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。引入Illumina桥式PCR兼容引物进行第二轮PCR扩增。第二轮PCR反应体系：2×Hieff? Robust PCR Master Mix 15 μL、primer F 1 μL、Index-PCR Primer R 1 μL、PCR products 20～30 ng、ddH2O 9～12 μL。第二轮PCR反应条件：95 ℃变性3 min；94 ℃退火20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环5次；72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆发酵中降解率的变化

由图1可以看出，秸秆降解率的变化趋势与潘云霞等^［18］利用复合菌系预处理稻秆的降解趋势具有一致之处。前4 d秸秆的降解速度最快，在4 d时，秸秆的降解率达30.35%，纤维素和木质素的降解率分别达27.07%和14.71%，较青格尔等^［19］筛选的复合菌系GF-20在玉米秸秆达到相似降解率时的时间缩短了11 d。6 d后，秸秆的降解率逐渐增加缓慢，其原因可能与代谢产物的抑制、底物的减少等因素有关^［20］。培养至12 d时，秸秆的降解率达40.02%，纤维素和木质素的降解率也分别达32.25%和20.93%，这表明该复合菌系在降解玉米秸秆方面具有较大潜力。

2.2 发酵体系内pH的变化

由图2可知，pH在前6 d由7.1迅速降至5.0随后又缓慢降至4.5，这可能是因为SCFAs生成速率的变化。之后由于SCFAs含量的降低和蛋白质的分解^［18］，使得pH在8 d后稍有增加，在12 d时达4.9左右，此变化趋势符合细菌复合菌群分解木质纤维素的特殊规律，是正常分解能力的体现，如果pH不能回升则证明复合菌群已经失去分解效果^［21］。这也意味着该复合菌系具有一定的pH调节能力。

2.3 短链脂肪酸的产生

发酵过程中短链脂肪酸的浓度变化如图3所示。由图3可以看出，复合菌发酵产酸过程中，乙酸在2 d时就处于较高浓度，达1.65 μg/mL，随后乙酸含量迅速下降，在6 d时降到0.75 μg/mL，之后基本保持恒定。丁酸浓度的变化趋势与乙酸相似。在整个发酵过程中，丙酸的浓度都较低，而且变化不大。复合菌处理秸秆12 d，异丁酸含量占总SCFAs的36.46%，乙酸含量占总SCFAs的33.15%，而丙酸和丁酸在整个秸秆发酵阶段都保持较低的含量，仅分别占SCFAs的10.65%和19.74%。这说明复合菌系发酵秸秆是以乙酸和异丁酸为主的丁酸型发酵。

2.4 复合菌系的物种组成

基于样品OTUs聚类分析，该复合菌系在门分类水平和属分类水平上的微生物相对丰度如图4所示。3个平行样品在门分类水平上细菌种类相对较少，主要含有厚壁菌门（Firmicute）和变形菌门（Proteobacteria），两者总相对丰度占98%以上。其在属分类水平上物种组成结构类似，但菌群相对丰度略有差异，可以看出优势菌属主要为Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等。

3 小结

1）本试验筛选的复合菌系降解玉米秸秆过程中，在前4 d的降解速度最快，秸秆、纤维素和木质素的降解率分别达30.35%、27.07%和14.71%，在12 d时，其降解率分别达40.02%、32.25%和20.93%。这表明筛选的复合菌系在降解木质纤维素方面有一定的效果。

2）复合菌系的代谢产物以异丁酸和乙酸为主，其含量分别占总短链脂肪酸的36.46%和33.15%，其中乙酸的最高含量达1.65 μg/mL。

3）该复合菌系主要由Clostridium sensu stricto、Cellulosilyticum、Clostridium XIVa、Enterobacteriaceae和Peptostreptococcaceae等优势菌属组成。

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收稿日期：2022-11-22

基金项目：安徽省省级重点基金项目（JZ2022QSKJ0010）

作者简介：汪文君（1998-），女，安徽黄山人，在读硕士研究生，研究方向为食品质量与安全，（电话）15256595484（电子信箱）980370781@qq.com；通信作者，刘国庆（1963-），男，教授，主要从事生物质资源高值化利用的研究，（电子信箱）13675512000@163.com。