重症肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表达与病情及预后的关系

高飞 张秀梅 金小乐 薛乾隆 王慧 张志斌

重症肺炎的病情发展迅速、死亡率较高[1-2]。呼吸衰竭是重症肺炎最常见的合并症，也是造成重症肺炎患者死亡的重要因素[3]。因此，研究重症肺炎合并呼吸衰竭患者病情及预后的评价方式具有积极的临床意义。目前临床上评价重症肺炎合并呼吸衰竭患者病情及预后的常规实验室指标包括WBC、CRP、降钙素原（procalcitonin，PCT）等，但是在国内多项重症肺炎相关研究中，上述实验室指标与预后关系的多因素回归分析结果差异较大[3-5]，目前尚缺乏能够有效预测预后的标志物。miRNA 是近年来备受关注的一类小分子RNA，能够分泌进入外周血并成为评价病情的标志分子。两项急性肺损伤相关的动物实验发现，miR-24 在急性肺损伤大鼠的肺组织中表达减少，而过表达miR-24 能够减轻急性肺损伤大鼠的病理改变及炎症反应[6-7]，提示miR-24 可能在肺部炎症反应的调控中起重要作用。基于此，本研究以重症肺炎合并呼吸衰竭患者为对象，探讨患者外周血miR-24 表达与病情及预后的关系，旨在为发现新的重症肺炎合并呼吸衰竭评价标志物提供临床证据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018 年10 月至2020 年12 月河北北方学院附属第一医院收治的106 例重症肺炎合并呼吸衰竭患者作为重症肺炎组。纳入标准：（1）符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》中重症肺炎的诊断标准[8]；（2）符合第8 版《内科学》中呼吸衰竭的诊断标准[9]；（3）临床资料完整。排除标准：（1）合并肺栓塞、肺部肿瘤、肺不张、肺水肿；（2）肺结核患者；（3）3 个月内使用过抗生素、激素。选取同期本院收治的184 例普通肺炎患者作为普通肺炎组，均符合肺炎诊断且不合并呼吸衰竭、未达到重症肺炎标准。选取同期在本院体检的100 名健康志愿者作为对照组。3 组研究对象性别、年龄、BMI、吸烟比例比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。本研究经河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会审查通过（批准文号：W20180027）。

表1 重症肺炎组患者miR-24表达水平与病情评价指标的相关性分析

表1 3组研究对象一般资料比较

1.2 外周血miR-24 表达水平检测 采用荧光定量PCR 法。抽取3 组研究对象外周静脉血5 mL，采用北京天根生物公司生产的试剂盒进行检测。首先，采用miRNA 提取分离试剂盒（批号：DP501，北京天根生化科技有限公司）提取外周静脉血中的miRNA，而后采用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒（批号：KR211，北京天根生化科技有限公司）将外周静脉血miRNA 反转录为cDNA。最后采用miRNA 荧光定量检测试剂盒（批号：FP411，北京天根生化科技有限公司）对cDNA中miR-24 表达水平进行检测，根据试剂盒说明书配置反应体系：cDNA 2 μL、反应混合液10 μL、10 μmol/L 上游和下游引物各0.6 μL、去离子水补足体系至20.0 μL。将反应体系放入荧光定量PCR 仪（型号：7500，赛默飞世尔科技公司），设置反应程序如下：95 ℃预变性3 min，而后95 ℃5 s、60 ℃15 s 重复40 个循环，得到循环曲线和循环阈值。以U6 为内参，根据2－ΔΔCt法计算miR-24 表达水平。

1.3 重症肺炎病情的评价及预后分组 查阅重症肺炎患者的病历，根据以下实验室检查指标评估病情：WBC、CRP、PCT、PaO2、PaCO2、pH 值、碳酸氢根（HCO3－）及急性生理学及慢性健康状况评分系统Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）。WBC 采用血常规仪（型号：BC-7500，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）检测，CRP、PCT 采用全自动生化分析仪（型号：BS-600M，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）检测，PaO2、PaCO2、pH 值、HCO3－采用动脉血气分析仪（型号：RAPIDPoint®500e，西门子医疗系统有限公司）检测，根据入院后24 h内各项指标的最差值计算APACHE Ⅱ评分。根据治疗结局将重症肺炎合并呼吸衰竭患者的预后分为存活和死亡。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。计数资料组间比较采用χ2检验。采用Pearson 相关分析重症肺炎组患者miR-24 表达水平与病情评价指标的相关性；采用多因素Cox 回归分析重症肺炎组患者预后的影响因素；采用ROC 曲线评估miR-24 表达水平对重症肺炎组患者预后的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组研究对象外周血miR-24 表达水平比较 重症肺炎组、普通肺炎组和对照组外周血miR-24 表达水平分别为0.70±0.19、0.86±0.25、1.00±0.21，3 组比较差异有统计学意义（F=53.060，P＜0.001），其中重症肺炎组低于普通肺炎组及对照组（均P＜0.05），普通肺炎组低于对照组（P＜0.05）。

2.2 重症肺炎组患者miR-24 表达水平与病情评价指标的相关性分析 Pearson 相关分析显示，重症肺炎组患者miR-24 表达水平与CRP、PCT、APACHE Ⅱ评分均呈负相关（均P＜0.05），与PaO2呈正相关（P＜0.01），与WBC、PaCO2、pH 值、HCO3－均无相关性（均P＞0.05），见表1。

2.3 重症肺炎组存活与死亡患者病情评价指标及miR-24 表达水平比较 重症肺炎组死亡患者CRP、PCT、APACHE Ⅱ评分均高于存活患者，PaO2、miR-24 表达水平均低于存活患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而重症肺炎组存活与死亡患者WBC、pH 值、PaCO2、HCO3－比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 重症肺炎组存活与死亡患者病情评价指标及miR-24表达水平比较

2.4 重症肺炎组患者预后影响因素的多因素分析以重症肺炎组患者预后作为因变量（赋值：存活=0、死亡=1），以PCT（连续变量）、CRP（连续变量）、PaO2（连续变量）、miR-24（连续变量）、APACHE Ⅱ评分（连续变量）作为自变量，对重症肺炎组患者预后的影响因素进行多因素Cox 回归分析，结果显示PaO2、APACHEⅡ评分、miR-24 均是重症肺炎组患者预后的影响因素（均P＜0.05），见表3。

表3 重症肺炎组患者预后影响因素的多因素分析

2.5 miR-24 表达水平预测重症肺炎组患者预后的ROC 曲线分析 ROC 曲线分析显示，miR-24 表达水平预测重症肺炎组患者预后的最佳截断值为0.639，AUC为0.780（95%CI：0.711～0.889），灵敏度和特异度分别为0.659 和0.826，提示miR-24 表达水平对重症肺炎组患者的预后具有预测价值，见图1。

图1 miR-24 表达水平预测重症肺炎组患者预后的ROC 曲线

3 讨论

重症肺炎是临床常见的呼吸系统危重症，救治难度大、死亡率高[10-12]。国内多项关于重症肺炎预后的研究发现，重症肺炎预后的影响因素复杂，合并呼吸衰竭、接受机械通气、PaO2降低、APACHEⅡ评分增加、心率加快等均是重症肺炎患者死亡的危险因素[3-5]。不同研究中呼吸衰竭及机械通气对重症肺炎患者预后影响的分析结果一致，但关于其他生命体征、实验室指标、评分等对重症肺炎患者预后影响的回归分析结果差异较大[3-5，13-15]，这不仅增加了临床上评价重症肺炎病情及预后的难度，也对寻找评价重症肺炎患者、尤其是重症肺炎合并呼吸衰竭患者病情及预后的标志物提出了新要求。

miRNA 是近些年备受关注的一类非编码小分子RNA，生物学作用广泛，参与增殖、凋亡、炎症、氧化应激等多个生物学环节的调控。Wu 等[16]研究显示重症肺炎患者外周血中多种miRNAs 表达改变且对患者急性呼吸窘迫的发生具有一定的预测价值。miR-24 是在多种组织中发挥保护作用的一种miRNA。心脑血管相关的研究证实，miR-24 能够减轻心肌缺血再灌注损伤、七氟醚诱导神经元损伤[17-18]。急性肺损伤相关的研究证实，miR-24 在急性肺损伤模型大鼠的肺组织中表达降低，过表达miR-24 显著减轻急性肺损伤模型大鼠肺组织的病理改变及炎症反应[6-7]。在上述miR-24 动物实验的基础上，本研究分析了重症肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表达的变化并发现：与普通肺炎患者及健康志愿者比较，重症肺炎合并呼吸衰竭患者外周血中miR-24 呈低表达，提示miR-24 低表达与重症肺炎合并呼吸衰竭的发病有关。

结合miR-24 在急性肺损伤大鼠中的保护及抗炎作用进行分析，重症肺炎合并呼吸衰竭发病过程中低表达的miR-24 能够削弱其保护及抗炎作用，进而造成肺损伤及炎症反应的加剧。为了进一步验证miR-24在重症肺炎合并呼吸衰竭发病过程中对病情的影响，本研究进行了相关性分析，选择WBC、CRP、PCT 3 项指标用于评价炎症反应程度，PaO2、PaCO2、pH 值、HCO3－4 项指标用于评价肺泡氧合功能及肺损伤程度，APACHE Ⅱ评分用于评价整体病情，分析结果显示：miR-24 与CRP、PCT、APACHE Ⅱ评分均呈负相关，与PaO2呈正相关，表明重症肺炎合并呼吸衰竭患者miR-24 的低表达与炎症反应加剧、肺泡氧合功能减退、整体病情加重有关，符合miR-24 介导的肺组织保护及抗炎作用。

本研究对比了重症肺炎组死亡与存活患者的miR-24 表达及病情，并进行多因素Cox 回归分析，结果发现，PaO2、miR-24、APACHE Ⅱ评分是重症肺炎合并呼吸衰竭患者预后的影响因素。其中PaO2、APACHE Ⅱ影响预后的分析结果与国内王新平[19]的研究结果一致；而miR-24 影响预后的可能机制是miR-24 表达的变化加重了病情。最后，通过ROC 曲线分析证实miR-24 表达水平对重症肺炎合并呼吸衰竭患者的预后具有预测价值。

综上所述，本研究结果表明重症肺炎合并呼吸衰竭患者外周血miR-24 表达水平降低与病情加重及预后恶化有关，并且miR-24 表达水平对患者的预后具有预测价值。当然，本研究也存在一定的不足之处：（1）重症肺炎组患者较少且均来自同一中心，会存在一定的选择偏倚，今后将开展多中心、大样本的随机对照研究以获得更确切的研究结论；（2）miR-24 不是临床常规开展的检验项目，这无疑制约了该指标的临床应用价值，待今后检测手段进步、在临床推广后，miR-24有望成为评估重症肺炎病情的临床标志物。