辣椒素纳米胶囊通过抑制PI3K/Akt/GSK-3β途径改善心肌纤维化的研究

梅毅，杨吉

浙江省人民医院毕节医院心胸血管外科，贵州毕节 551705

近年来，我国老龄化问题及老龄人群面对的公共卫生安全问题越发突出，心血管疾病作为危害老龄人生命安全的重要因素，进一步探讨其机制受到社会各界的关注。心肌梗死是临床常见病，若不及时治疗，随着病情进展，持续过度心肌重构可引起充血性心衰，在心肌重构中，心肌纤维化是一项关键环节，故探索一种可减轻心肌纤维化的方法或药物对治疗心肌梗死意义重大[1-3]。磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（Phosphatidylinositol Kinase 3-Kinase/Protein Kinase B/Glycogen Synthase Kinase 3β, PI3K/Akt/GSK-3β）通路在心脏保护、细胞代谢与增殖方面具有重要生理作用，大量研究表明，PI3K/Akt/GSK-3β通路在心血管疾病发生中发挥重要作用。辣椒素具有多种生物学功能，包括抗氧化、神经保护、抗炎、抗细胞凋亡等，在实验研究及临床治疗中具有重要价值[4-5]。国内关于辣椒素纳米颗粒（Capsaicin/Nanoparticles, Cap/NPs）胶囊的报道甚少，关于Cap/NPs胶囊与心血管疾病方面研究几乎空白。本文于2022年1月—2023年6月自贵州医科大学动物中心购进40只雄性健康Sprague-Dawley（SD）大鼠，通过动物实验，探讨Cap/NPs胶囊对心肌梗死后心肌纤维的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

实验动物：购进40只雄性健康SD大鼠，在适应性喂养7 d后，以随机数表法分为4组，分别为正常对照组、假手术组、模型组、干预组，每组10只。各组大鼠体质量230～250 g，各组体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究通过动物伦理审批（伦审动2024-1-1号）。

主要试剂与仪器：辣椒素为德斯特生公司提供，纯度：98%；聚乳酸-轻基乙酸共聚物为Sigma公司提供，分子量7 000～17 000；台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪，型号：TGL-16M；牛血清白蛋白产自阿拉丁公司，为96%生物技术级；Agilent高效液相色谱仪型号为1260Infinity Il；新芝超声波细胞粉碎机型号为SCIENTZ-IID；生物化学药品P-c-Raf规格：100 μl；生物化学药品P-GSK-3b规格：100 μl）；生物化学药品P-akt473，生物化学药品P-akt308，生物化学药品P-PDK1；化学试剂助剂Masson三色染色试剂盒；化学试剂助剂×1型胶原ELisa Kit（96t）；高效RIPA裂解液。上海生工公司提供ELISA试剂盒，CAP/NPs胶囊由医院实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型构建与分组 模型构建：模型组与干预组大鼠予以95%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，心脏暴露后，对左冠状动脉结扎，术后予以青霉素（国药准字H14022564；规格：250万U）40 000 U/d。假手术组采取相同操作，但不进行结扎处理。对照组不予以任何干预，为正常大鼠。

分组：术后成功存活12 h大鼠分为模型组和干预组，干预组术后1 d给予大鼠Cap/NPs胶囊，35 mg/kg）1次/周；模型组术后1 d予以等量口服生理盐水，持续4周。

1.2.2 标本处理 术后4周处死大鼠，取心肌组织，做相关指标检测。

1.3 观察指标

血清指标：包括血清激活素A（Activin A, ACTA）、心房钠尿肽（Atrial Natriuretic Peptide, ANP）、脑钠肽（Brain Natriuretic Peptide, BNP）、基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinases, MMP-9）、胶原纤维蛋白Ⅲ等。末次给药24 h后采集大鼠血液标本，标本进行离心处理后，使用ELISA法对上述指标进行检测。

PI3K/Akt/GSK-3β蛋白：各组大鼠心脏组织剪碎处理，分别加入适量的RIPA组织裂解液，提取标本中的总蛋白，蛋白浓度使用BCA试剂盒测定，调整各组蛋白浓度，对标本进行加热变性处理，取样品液20 μL进行电泳处理，将分离蛋白用湿转法转移至硝酸纤维膜上，封闭处理2 h，在孵育盒中依照分子量置入目的蛋白条带，分别加入兔源一抗[p-GSK-3β（1:250）、GSK-3β（1:250）、p-Akt（1:250）、Akt（1:250）、p--PI3K（1:300）、PI3K（1:300）]，4℃冰箱过夜，3次漂洗，按1∶1 000稀释后加入羊抗兔二抗，温室孵育2 h，再次漂洗3次，增强化学发光法显色，然后于标本凝胶成像仪观察条带并拍照，组织中蛋白表达使用Image-J软件分析。

1.4 统计方法

利用SPSS 22.0统计学软件处理数据，血清指标、PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达情况为符合正态分布的计量资料，以（）表示，进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清指标比较

与对照组比较，假手术组、模型组与干预组大鼠的ACT-A、ANP、BNP、MMP-9、胶原纤维蛋白Ⅲ水平均升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）；假手术组大鼠各指标低于模型组与干预组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；模型组大鼠各指标明显高于干预组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清指标比较()

表1 各组大鼠血清指标比较()

注：ACT-A：血清激活素A，ANP：心房钠尿肽，BNP：脑钠肽，MMP-9：基质金属蛋白酶-9；与对照组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，@P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

胶原纤维蛋白Ⅲ（ng/mL）26.13±1.30（28.63±1.54）*（67.62±1.85）*@（35.71±1.65）*@#组别对照组（n=10）假手术组（n=10）模型组（n=10）干预组（n=10）ACT-A（pg/mg）1.03±0.15（1.26±0.14）*（2.33±0.28）*@（1.60±0.17）*@#ANP（pg/mg）1.15±0.23（1.16±0.20）*（2.21±0.57）*@（1.45±0.38）*@#BNP（ng/L）62.05±7.40（70.44±9.95）*（212.04±17.36）*@（118.62±13.40）*@#MMP-9（ng/L）65.07±8.26（73.19±8.57）*（221.65±23.34）*@（126.08±14.56）*@#

2.2 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达比较

对照组大鼠的PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达明显高于其余3组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；假手术组PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达明显高于模型组与干预组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；模型组PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达则明显低于干预组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达比较()

表2 各组大鼠心肌组织PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达比较()

注：p-GSK-3β：磷酸化葡萄糖合成激酶3β抗体，GSK-3β：糖原合成酶激酶3β，p-AKT：磷酸化蛋白激酶B，Akt：蛋白激酶B，p-PI3K：磷酸化磷酸肌醇3激酶，PI3K：磷酸肌醇3激酶；与对照组比较，*P＜0.05；与假手术组比较，@P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

p-PI3K/PI3K 1.34±0.26（1.13±0.19）*（0.19±0.03）*@（0.69±0.14）*@#组别对照组（n=10）假手术组（n=10）模型组（n=10）干预组（n=10）p-GSK-3β/GSK-3β 1.32±0.27（1.10±0.18）*（0.23±0.05）*@（0.74±0.13）*@#p-AKT/AKT 1.33±0.24（1.11±0.15）*（0.24±0.04）*@（0.70±0.12）*@#

3 讨论

心肌梗死作为一种常见心血管疾病，主要因心肌缺血、缺氧所致，可引起休克、心律失常，甚至造成心衰，对患者生命构成威胁[6]。心肌梗死发生后局部重要组织会出现纤维化病变，在光学显微镜下可见附壁性血栓、内膜组织增厚、肌浆空泡化、白色纤维条，随着病情进展，可引起心肌僵硬度增加、体积增大的症状，电生理结构失常、舒张与收缩功能降低，最终诱发猝死[7-8]。故进一步探索对预防心肌梗死组织纤维化病变的药物，对改善患者预后的意义重大。

Cap/NPs是一种新型药物，辣椒素受体TRPV1属于非选择性配体门控阳离子通道，由6个跨膜蛋白构成，分子量为95 kDa，由838个氨基酸组成，当其与辣椒素结合后开放通路，细胞外钙离子进入细胞内，改变内外电荷平衡，发挥一系列生物效果，如抗氧化、抗细胞凋亡、抗炎、镇痛、神经保护等[9-10]。推测Cap/NPs胶囊在治疗心脏损伤方面具有一定积极作用。本研究结果显示，模型组ACT-A（2.33±0.28）pg/mg、ANP（2.21±0.57）ng/L、BNP（212.04±17.36）ng/L、MMP-9（221.65±23.34）ng/L、胶原纤维蛋白Ⅲ（67.62±1.85）ng/mL明显高于干预组（P均＜0.05），说明Cap/NPs胶囊可一定程度减轻大鼠心肌损伤，预防心肌组织的纤维化发展。关于其具体机制目前尚不清楚，需要进一步研究。

PI3K/Akt/GSK-3β通路在心肌细胞凋亡、组织损伤中发挥关键作用，其中GSK-3β是PI3K/Akt通路的作用底物，属于保守丝氨酸/苏氨酸激酶家族，PI3K/Akt通路被激活后，可进一步强化GSK-3β磷酸化作用，抑制GSK-3β活性，降低细胞中线粒体的通透性，抑制细胞凋亡[11]。本研究显示，对于干预组大鼠使用Cap/NPs胶囊治疗后，模型组心肌组织PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达水平（0.19±0.03）%、（0.24±0.04）%、（0.23±0.05）%均明显低于干预组（P均＜0.05），说明Cap/NPs胶囊对心肌梗死大鼠心肌纤维化病变的改善可能通过PI3K/Akt/GSK-3β信号通路起到作用，从而降低心肌细胞凋亡，减轻心肌组织纤维化程度，保护心肌组织。胡芮嘉等[12]研究中显示，与研究干预组对比，模型组大鼠的PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达[（0.38±0.07）%、（0.37±0.06）%、（0.40±0.07）%]呈现出明显下降趋势（P均＜0.05），与本研究结果基本一致。

综上所述，大鼠心肌梗死模型建立后予以Cap/NPs胶囊干预，能够有效抑制心肌纤维化发展，减轻大鼠心肌损伤，其机制可能与PI3K、Akt、GSK-3β蛋白活性调控及PI3K/Akt/GSK-3β信号通路传导抑制有关。