宏基因组二代测序在下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液中的病原学诊断价值

程长昆 姜长舟

下呼吸道感染是指喉以下的气管、支气管、肺泡等部位发生的感染性疾病［1］。下呼吸道感染的病原体十分复杂，以细菌和真菌为主要致病因素［2］。及时准确地鉴定下呼吸道感染的病原体，对于指导临床合理用药、降低耐药率、改善患者预后具有重要意义［3］。目前，临床上常用的下呼吸道感染病原体检测方法主要有传统的微生物培养、分子生物学检测和宏基因组二代测序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）等［4-7］。近年来，mNGS在下呼吸道感染的病原学诊断中逐渐展现出其优势和潜力［8-10］。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）是利用支气管镜对肺段或亚肺段进行灌洗后采集到的肺泡表面液体，是目前最能反映下呼吸道感染的病原体分布情况的标本，具有较高的代表性和准确性［11］。因此，本研究采用mNGS和常规培养检测方法对下呼吸道感染患者BALF中的病原体进行分析，探讨2种方法的优缺点和一致性，以及mNGS检出阳性与患者临床指标和预后的关系，为临床提供有价值的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性收集2020年4月至2023年3月安庆市望江县医院内科130例下呼吸道感染患者的临床资料。根据mNGS是否检出病原体，将患者分为检出组100例和未检出组30例。两组患者年龄、性别和基础疾病比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。本研究符合伦理原则，经过医院伦理委员会批准（伦理编号：2023-LC-003）。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：①年龄≥18岁者；②以《诸福棠实用儿科学》（第8版）［12］中下呼吸道感染的诊断标准为金标准，包括社区获得性肺炎、医院获得性肺炎、呼吸机相关性肺炎等者；③入院后24 h内进行支气管镜检查并采集BALF样本者；④BALF样本同时进行mNGS和常规培养检测者。排除标准：①合并其他部位的感染性疾病者；②BALF样本不符合质量要求，如回收率低于30%、细胞总数低于104/mL、中性粒细胞比例高于80%等者；③BALF样本在运输或保存过程中发生污染或损坏者；④患者或其家属不同意参与本研究者。

1.3 方法 所有患者均在入院后24 h内进行支气管镜检查，按照标准操作程序采集BALF样本，每个肺段或亚肺段灌注生理盐水20～40 mL，回收率不低于30%，回收液体立即分装为2份，一份用于mNGS检测，另一份用于常规培养检测。

1.3.1 mNGS检测 采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取BALF样本中的总核酸，采用NEBNext Ultra Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美国）构建文库，采用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端150 bp高通量测序。测序数据经过质量控制、去除人源序列、去除低质量序列、去除重复序列等步骤后，与NCBI数据库进行比对分析，根据比对结果确定病原体种类和相对丰度。设定检出阈值为每百万条reads中至少有5条reads与目标序列匹配。

1.3.2 常规培养检测 将BALF样本接种于血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、MacConkey琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基等不同培养基上，置于37℃恒温箱中培养24～48 h，观察菌落生长情况，按照常规方法进行菌种鉴定和药敏试验。同时将BALF样本接种于液体培养基中，置于自动血培养仪中培养5 d，观察是否有阳性信号产生，如有阳性信号，则进行菌种鉴定和药敏试验。另外，将BALF样本制成涂片，在油镜下观察是否有真菌或寄生虫存在。

1.4 观察指标 主要观察指标为mNGS和常规培养检测的阳性率、检测病原体的分布、病原体检测的一致性。次要观察指标为mNGS检出组和未检出组患者的临床指标、治疗方案、预后情况及影响mNGS检出阳性的因素。其中，临床指标包括外周血白细胞、C反应蛋白、降钙素原、中性粒细胞计数及血清中细胞因子的浓度。预后情况包括住院时间、转入ICU的比例、机械通气的比例及病死率等。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料均符合正态分布以表示，两组间均数比较采用t检验；计数资料以频数和百分比表示，两组间比较采用χ2检验。mNGS与常规培养检测结果的一致性采用Kappa系数进行评价，Kappa值在0.01～0.20为无一致性，0.21～0.40为较低一致性，0.41～0.60为中等一致性，0.61～0.80为较高一致性，0.81～1.00为完全一致性。影响mNGS检出阳性的因素采用logistic多因素回归分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS和常规培养检测结果比较 mNGS检测结果显示，130例下呼吸道感染患者BALF中共检出病原体100株，未检出寄生虫。mNGS检出阳性率为76.9%（100/130）。常规培养检测结果显示，130例下呼吸道感染患者BALF中共检出病原体56株，未检出非典型病原体和寄生虫。mNGS与常规培养检测的阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=31.026，P＜0.001）。见表2。以《诸福棠实用儿科学》（第8版）中下呼吸道感染的诊断标准为金标准，分别以常规培养及mNGS检测结果为检验变量，绘制受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线。ROC曲线显示，mNGS检测的曲线下面积（area under the curveAUC）为0.84，而常规培养检测的AUC为0.76。见图1。

图1 mNGS与常规培养的ROC曲线分析

表2 mNGS和常规培养检测的阳性率和病原体分布比较

2.3 两组患者临床指标和预后比较 mNGS检出组与未检出组在外周血白细胞、C反应蛋白、降钙素原、中性粒细胞计数及血清中细胞因子浓度差异均有统计学意义（P＜0.05）。mNGS检出组患者的住院时间、转入ICU的比例、机械通气的比例、病死率等预后指标均高于未检出组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组患者临床指标比较

2.4 影响mNGS检出阳性的多因素logistic回归分析将mNGS检出阳性作为因变量，将年龄、性别、基础疾病、外周血白细胞、C反应蛋白、降钙素原、中性粒细胞计数及血清中细胞因子等作为自变量。连续变量（年龄、外周血细胞、C反应蛋白、降钙素原、中性粒细胞计数、血清中细胞因子）以原始数值表示，二分类变量：性别（0=女性，1=男性）和基础疾病（0=无，1=有）。采用逐步回归法进行多因素logistic回归分析，结果显示，年龄、基础疾病、外周血白细胞和C反应蛋白是影响mNGS检出阳性的危险因素。见表4。

表4 影响mNGS检出阳性的多因素logistic回归分析

3 讨论

下呼吸道感染是一种常见的呼吸系统疾病，其病原体复杂多样，及时准确地鉴定病原体对于指导临床合理用药、降低耐药率、改善患者预后具有重要意义。本研究采用mNGS和常规培养检测方法对下呼吸道感染患者BALF中的病原体进行分析，探讨两种方法的优缺点和一致性，以及mNGS检出阳性与患者临床指标和预后的关系，为临床提供有价值的参考。

本研究结果显示，mNGS检出阳性率高于常规培养检测，差异有统计学意义（P＜0.001），与张彩霞等［13］的研究结果一致。这可能与mNGS能够同时检测样本中所有类型的核酸序列，从而鉴定出多种已知或未知的微生物有关，而常规培养检测受限于培养条件、培养时间、抗生素干扰等因素，不能检测非培养性或难培养性微生物。

本研究结果显示，mNGS与常规培养检测结果在细菌、真菌和非典型病原体方面具有中等一致性（Kappa=0.42～0.54），在病毒和寄生虫方面具有较低一致性（Kappa=0.12～0.25）。可能与以下原因有关：①mNGS能够检测出常规培养检测难以发现的病原体，如非培养性或难培养性微生物、新发现的微生物等；②mNGS能够区分不同菌属或菌种之间的微小差异，而常规培养检测可能将其归为同一类；③mNGS可能检测到一些非致病性或低致病性的微生物，如皮肤或口腔的正常菌群，而常规培养检测可能忽略其存在；④mNGS可能检测到一些已经死亡或被抑制的微生物的核酸残留，而常规培养检测只能检测活性的微生物［14-15］。因此，mNGS与常规培养检测结果之间存在一定的差异，不能完全替代或否定彼此，而应结合临床综合判断。

本研究结果显示，mNGS检出阳性与患者年龄、基础疾病、外周血白细胞和C反应蛋白等因素相关，提示mNGS可作为下呼吸道感染患者病情评估和预后判断的辅助手段。mNGS检出组患者的外周血白细胞、C反应蛋白、降钙素原、中性粒细胞计数及血清中细胞因子等炎症指标均高于未检出组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明mNGS检出阳性反映了患者体内存在较强的炎症反应［16-17］。mNGS检出阳性提示患者预后不良［18-19］。多因素logistic回归分析显示，年龄、基础疾病、外周血白细胞和C反应蛋白是影响mNGS检出阳性的危险因素，表明这些因素与患者体内病原体负荷和感染严重程度有关［20］。

本研究有以下局限性：①本研究为回顾性对照研究，存在选择偏倚和混杂因素的可能；②本研究纳入的患者数量较少，可能影响结果的稳定性和可信度；③本研究未对mNGS检测到的非致病性或低致病性微生物进行进一步验证，可能导致结果的过度解释或误解。

综上所述，mNGS在下呼吸道感染患者BALF中的病原学诊断中具有较高的敏感性和广谱性，能够检测出常规培养检测难以发现的病原体，对于指导临床合理用药和改善患者预后有重要意义。mNGS与常规培养检测结果之间存在一定的差异，不能完全替代或否定彼此，而应结合临床综合判断。