基于JNK信号通路和线粒体氧化应激研究儿茶素拮抗对乙酰氨基酚诱导肝损伤的作用机制

孙武燕，张 娟，张 炫，王春宝，彭秋玲，白庆云

• 药理与临床•

基于JNK信号通路和线粒体氧化应激研究儿茶素拮抗对乙酰氨基酚诱导肝损伤的作用机制

孙武燕，张 娟#，张 炫，王春宝，彭秋玲，白庆云*

宜春学院化学与生物工程学院，江西 宜春 336000

基于c-jun末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）信号通路探讨儿茶素对对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱导肝损伤的作用及机制。ICR小鼠随机分为对照组、模型组以及儿茶素（50、100 mg/kg）组，小鼠连续3 d ig儿茶素，末次给予儿茶素1 h后ip APAP（400 mg/kg），6 h后采用苏木素-伊红（HE）染色评估小鼠肝脏组织病变，检测血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及肝脏中谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；考察儿茶素对细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）代谢酶活性的影响。人正常肝细胞L02给予40、80 μmol/L儿茶素，15 min后给予15 mmol/L APAP孵育6 h，检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、线粒体膜电位变化、线粒体呼吸链复合物I活性、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量、胞质B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、第2个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（second mitochondria-derived activator of caspases，Smac）、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）蛋白表达以及线粒体动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）、线粒体融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）、Bax蛋白表达和p-JNK、JNK蛋白表达。给予JNK激活剂后，考察儿茶素对APAP诱导的肝细胞损伤作用。儿茶素显著降低APAP诱导的肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性（＜0.05、0.01），显著升高肝脏GSH水平和SOD活性（＜0.05、0.01），改善肝脏损伤。儿茶素显著升高APAP处理的L02细胞存活率、线粒体膜电位、呼吸链复合物I活性和ATP水平（＜0.05、0.01），显著降低ROS水平（＜0.05），显著下调线粒体中Drp1、Bax和胞质中Smac、AIF蛋白表达（＜0.05），显著上调线粒体中Mfn2和胞质Bax的蛋白表达（＜0.05），并抑制JNK的磷酸化水平（＜0.05）。给予JNK激活剂后，儿茶素的抗氧化作用和对肝脏的保护作用明显减弱（＜0.05、0.01）。儿茶素通过抑制JNK信号通路减轻线粒体氧化应激，进而拮抗APAP诱导的肝损伤。

儿茶素；对乙酰氨基酚；肝损伤；线粒体氧化应激；JNK信号通路

药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）是由多种药物及其代谢产物引起的肝脏疾病[1]。对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）属于非甾体抗炎药，也是诱发DILI最为常见的药物。过量的APAP可诱导肝细胞线粒体的氧化/亚硝化应激和细胞内信号传导。过氧亚硝酸盐具有细胞毒性，氧化硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）导致细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulated kinase 1，ASK1）的活化[2-3]。ASK1与活化的混合谱系激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）通过丝裂原活化蛋白激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）磷酸化将c-jun末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JNK）激活为磷酸化形式，使磷酸化JNK易位至线粒体。磷酸化的JNK会通过Src介导的通路进一步抑制线粒体电子运输[4-6]。B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）和糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）易位到线粒体，进一步激活线粒体氧化应激[7]。这些会改变线粒体的通透性并释放线粒体膜间蛋白，如核酸内切酶G、凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）、细胞色素C和第2个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂（second mitochondria-derived activator of caspases，Smac）。AIF和核酸内切酶G向细胞核的易位导致细胞核DNA断裂及细胞坏死，进而引起肝损伤。

儿茶素是存在于儿茶、罗布麻、银杏叶等药用植物中的多酚类化学物质[8]，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等多种药理作用[9]，可用于治疗心血管[10]、肝脏[11]等疾病。关于儿茶素类化合物先前的研究表明，表儿茶素对APAP诱导的急性肝损伤具有保护作用，其作用机制为抗炎和抗细胞凋亡活性[12]。表没食子儿茶素-3-没食子酸（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）通过降低血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性、减轻氧化应激、抑制细胞凋亡和减少APAP的毒性产物，进而减轻APAP诱导的肝损伤[13-14]。最近一项研究表明，EGCG对肝脏的保护作用是通过降低APAP诱导的血清ALT活性，改善肝线粒体膜电位和呼吸链复合物[15]。上述研究表明，儿茶素异构体可以减轻APAP诱导的肝毒性，但其具体作用机制尚未阐明。同样，关于儿茶素本身在APAP肝毒性中的作用和机制也鲜有报道。由于JNK在APAP诱导的肝毒性中起着关键作用，因此本研究旨在探讨儿茶素是否能够通过体内外调节JNK信号通路来减轻APAP诱导的肝毒性。

1 材料

1.1 动物和细胞

清洁级雄性ICR小鼠36只，8～10周龄，体质量（25±35）g，购自湖南斯莱克景达试验动物公司，合格证号SCXK（湘）2016-0002。动物饲养于温度（22±2）℃、自动通风、明暗光照周期12 h/12 h、相对湿度（50±5）%的环境中，自由进食饮水，实验前适应性喂养1周。动物实验经宜春学院动物伦理委员会批准，批准号为伦审科第2023（035）号。

人正常肝细胞L02由上海中医药大学季莉莉教授赠予。

1.2 药品与试剂

儿茶素（质量分数≥98.0%，批号P10A8F41490）购自上海源叶生物科技有限公司；APAP（质量分数≥99.0%，批号C10090929）购自上海麦克林生化科技有限公司；JNK激活剂茴香霉素（批号20191122）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）测定试剂盒（批号20180321）、线粒体膜电位测定试剂盒（批号20210708）、BCA蛋白检测试剂盒（批号37）均购自上海碧云天生物技术有限公司；RIPA裂解缓冲液（批号170319）购自美国GIBCO生物技术公司；Vivid®CYP2E1检测试剂盒（批号2833633）、Vivid®CYP3A4检测试剂盒（批号2834649）、Vivid®CYP1A2检测试剂盒（批号2830166）均购自赛默飞世尔科技有限公司；DDTC（批号161910）；酮康唑（批号2102G48）均购自上海源叶生物科技有限公司；呋拉茶碱（批号ST023）购自范德生物科技有限公司；ALT检测试剂盒（批号20200306）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒（批号20200404）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒（批号20210610）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）测定试剂盒（批号20210925）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）检测试剂盒（批号20220106）、线粒体呼吸链复合体I测定试剂盒（批号20201215）、线粒体提取试剂盒（批号10124339）均购自南京建成生物工程研究所；β-actin抗体（批号15）、细胞色素C氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV，COX IV）抗体（批号4）、Bax抗体（批号12）、AIF抗体（批号3）、Smac抗体（批号1）、T-JNK抗体（批号15）、p-JNK抗体（批号15）、动力相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抗体（批号3）、线粒体融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）抗体（批号3）、二抗（批号10）购自美国CST公司；其他试剂均为分析试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器

Ti2-U型荧光显微镜（日本Nikon公司）；2IR型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；BWS-10型恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；1681130A型Imark酶标仪、703930型蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司）；S10型手提式高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；AR224CN型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；VORTEX-5型漩涡混合仪（上海析域仪器设备有限公司）；722型可见光分光光度计（上海佑可仪表有限公司）；HP型AlphaImager凝胶成像系统（美国Alpha科技有限公司）；IMS-20型雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药

36只ICR小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、模型组和儿茶素低、高剂量（50、100 mg/kg）组，每组9只。APAP溶于温热无菌生理盐水溶液中，儿茶素溶于0.01% PBS溶液中。儿茶素组小鼠连续3 d ig药物，对照组给予等体积的生理盐水，末次给药1 h后模型组和儿茶素组小鼠ip APAP（400 mg/kg），对照组ip等体积的生理盐水，6 h后麻醉，心脏取血，采集肝脏。

2.2 血清ALT和AST活性检测

将各组小鼠血液置于冰上3 h，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定血清中ALT和AST活性。

2.3 肝组织苏木素-伊红（HE）染色

将小鼠肝大叶置于10%中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片后进行HE染色，于显微镜下观察并拍照，采用Suzuki评分[16]对肝组织结构损伤程度进行半定量分析。

2.4 肝脏SOD活性和GSH水平测定

取各组肝组织适量，加入9倍量的生理盐水，匀浆后4 ℃、4 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。按照试剂盒说明书测定肝组织中SOD活性和GSH水平。

2.5 细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）代谢酶活性测定

将制备好的肝微粒体加入不同浓度的儿茶素（0.3、1、3、10、30、100 μmol/L），按照试剂盒说明书分析儿茶素对CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4酶活性的影响。DDTC、呋拉茶碱和酮康唑为细胞色素P4502E1、P4503A4、P4501A2的阳性抑制剂，计算阳性抑制剂的抑制率。

抑制率＝1－(X－B)/(A－B)

X、A和B分别代表儿茶素、溶剂对照和阳性抑制剂的速率

2.6 儿茶素对APAP诱导的L02细胞氧化应激、线粒体损伤和p-JNK蛋白表达的影响

2.6.1 细胞培养 L02细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。

2.6.2 ROS水平的测定 将L02细胞以1×105个/孔接种于6孔板中，设置对照组、模型组和儿茶素低、高剂量（40、80 μmol/L）组。待细胞贴壁后，儿茶素组分别加入不同浓度的儿茶素溶液孵育15 min，然后模型组和儿茶素组再加入APAP（15 mmol/L）孵育6 h。加入DCFH-DA探针孵育20 min，于荧光显微镜下检测荧光强度。

2.6.3 线粒体膜电位的测定 按照“2.6.2”项下方法进行分组和给药，药物处理后，弃去培养液，PBS清洗细胞，加入0.5 mL细胞培养液和0.5 mL JC-1染色工作液，充分混匀。将孔板放于细胞培养箱中37 ℃孵育30 min，随后吸弃培养液，各孔用1 mL JC-1染色缓冲液洗涤2次，并加入1 mL细胞培养液于荧光显微镜下观察线粒体荧光的强弱。

2.6.4 细胞中ATP含量的测定 L02细胞以2×106个接种于直径为6 cm的培养皿中，待细胞贴壁后，加入APAP（15 mmol/L）分别孵育0、6、12、18、24 h，按ATP检测试剂盒说明书检测ATP含量，用可见光分光光度计于636 nm处检测各组吸光度（）值，计算ATP含量。

L02细胞以2×106个接种于直径为6 cm的培养皿中，设置对照组、模型组及儿茶素低、高剂量（40、80 μmol/L）组和儿茶素（80 μmol/L）单独给药组。待细胞贴壁后，儿茶素组分别加入不同浓度的儿茶素溶液孵育15 min，然后模型组和儿茶素组再加入APAP（15 mmol/L）孵育6 h。按ATP检测试剂盒说明书检测ATP含量。

2.6.5 线粒体呼吸链复合物I活性的测定 L02细胞以2×106个接种于直径为6 cm的培养皿中，按照“2.6.2”项下方法进行分组，待细胞贴壁后，儿茶素组分别加入不同浓度的儿茶素溶液孵育15 min，然后模型组和儿茶素组再加入APAP（15 mmol/L）孵育6 h。使用线粒体提取试剂盒提取线粒体。复合物I会催化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）转化为烟酰胺腺嘌呤四核苷酸。因此，根据试剂盒说明书，通过测量340 nm处值来计算线粒体呼吸链复合物I活性，以确定NADH的转化率。

2.6.6 Western blotting检测胞浆Bax、Smac、AIF和线粒体Mfn2、Drp1、Bax蛋白表达 L02细胞以2×106个接种于直径为6 cm的培养皿中，设置对照组、模型组及儿茶素低、高剂量（40、80 μmol/L）组和儿茶素（80 μmol/L）单独给药组。待细胞贴壁后，儿茶素组分别加入不同浓度的儿茶素溶液孵育15 min，然后模型组和儿茶素组再加入APAP（15 mmol/L）孵育6 h。收集细胞，用RIPA裂解缓冲液提取胞质蛋白，线粒体提取试剂盒提取线粒体蛋白。测定蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，孵育一抗和二抗，使用化学发光试剂盒显影，使用β-actin或COX IV作为内部参照，对蛋白条带的灰度进行量化分析。

2.6.7 Western blotting检测细胞p-JNK、JNK蛋白表达 L02细胞以2×106个接种于直径为6 cm的培养皿中，待细胞贴壁后，加入APAP（15 mmol/L）分别孵育0、0.5、1、3、6、12、24 h，收集细胞，用RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，检测p-JNK、JNK蛋白表达。

按“2.6.6”项下方法处理细胞和给药，收集细胞，用RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，检测p-JNK、JNK蛋白表达。

2.7 JNK激活剂茴香霉素对儿茶素保护肝细胞作用的影响

L02细胞以2×106个接种于直径为6 cm的培养皿中，设置对照组、模型组和茴香霉素低、高剂量单独给药（5、15 nmol/L）组。待细胞贴壁后，先用茴香霉素孵育15 min，然后加入APAP（15 mmol/L）孵育6 h。收集细胞，收集细胞，提取蛋白，检测p-JNK、JNK蛋白表达。

设置对照组、模型组、儿茶素（80 μmol/L）组和儿茶素＋茴香霉素（15 nmol/L）组，细胞先加入茴香霉素孵育15 min，再加入儿茶素孵育15 min，然后加入APAP孵育6 h。采用CCK-8法测定细胞活力，按照“2.6.3”项下方法测定线粒体膜电位水平，按照“2.6.4”项下方法测定细胞中ATP含量，按照“2.6.5”项下方法测定线粒体呼吸链复合物I活性，按照“2.6.6”项下方法测定胞质Bax、Smac、AIF和线粒体Mfn2、Drp1、Bax蛋白表达，按照“2.6.7”项下方法检测p-JNK、JNK蛋白表达。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 儿茶素减轻APAP诱导的小鼠肝损伤

为了确定小鼠肝损伤的程度，检测血清中ALT和AST活性。如图1-A所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性均显著升高（＜0.05）；与模型组比较，儿茶素（50、100 mg/kg）组小鼠血清中ALT和AST活性均显著降低（＜0.05、0.01）。HE染色结果如图1-B、C所示，与对照组比较，模型组小鼠血管周围肝脏组织结构遭到大面积的破坏，实质性肝小叶中心坏死、肝窦充血，Suzuki评分明显升高（＜0.01）；给予儿茶素后，肝脏组织损伤得到明显的改善，Suzuki评分明显降低（＜0.01）。

A-小鼠血清中ALT和AST活性；B-小鼠肝组织HE染色病理学评估（×200）；与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01。

3.2 儿茶素对APAP代谢酶活性的影响

CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4是CYP450体系中的一员，它们在APAP的代谢活化中起重要作用[17]。如图2所示，儿茶素对CYP2E1和CYP1A2酶活性没有影响。低浓度的儿茶素对CYP3A4活性无影响，而高浓度（100 μmol/L）的儿茶素对CYP3A4活性具有一定的抑制作用，但与阳性对照组相比均无统计意义。

图2 儿茶素对CYP450代谢酶活性的影响(, n = 3)

3.3 儿茶素减轻APAP诱导的氧化应激

SOD和GSH是机体重要的抗氧化剂。如图3-A、B所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织GSH水平和SOD活性均显著降低（＜0.05）；与模型组比较，儿茶素（50、100 mg/kg）组小鼠肝组织GSH水平和SOD活性均显著升高（＜0.05、0.01）。

ROS水平的增加与线粒体氧化应激有关。用荧光染色法检测儿茶素对APAP诱导的L02细胞氧化应激的抗氧化作用。如图3-C、D所示，与对照组比较，APAP显著增加细胞ROS含量（＜0.05），儿茶素（40、80 μmol/L）可以显著降低APAP诱导的ROS含量（＜0.05）。

A-小鼠肝脏中GSH水平；B-小鼠肝脏中SOD活性；C、D-L02细胞给予40、80 μmol·L−1儿茶素，15 min后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测ROS水平（×100）；与对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01。

3.4 儿茶素减轻APAP诱导的线粒体损伤

细胞给予APAP（15 mmol/L）分别孵育0、6、12、18、24 h，检测ATP浓度。如图4-A所示，APAP（15 mmol/L）在24 h内呈时间相关性地降低ATP浓度（＜0.05）。细胞用儿茶素（40、80 μmol/L）处理15 min，然后给予APAP（15 mmol/L）孵育6 h，如图4-B所示，与模型组比较，儿茶素（40、80 μmol/L）组ATP浓度显著升高（＜0.05）。如图4-E所示，与模型组比较，儿茶素（80 μmol/L）组线粒体呼吸链复合物I活性明显增加（＜0.05）。结果表明，过量的APAP导致线粒体呼吸链复合体I活性显著降低，用儿茶素预处理可以恢复线粒体呼吸链复合物I的活性。

红色（聚集体）/绿色（单体）荧光强度比的降低表明线粒体膜损伤导致去极化。如图4-C、D所示，模型组观察到绿色荧光强度增加，40、80 μmol/L儿茶素预处理导致APAP处理的细胞中红色荧光显著增加（＜0.05、0.01）。以上结果表明儿茶素处理可阻止线粒体膜的去极化。

Bax、Smac和AIF是细胞凋亡相关蛋白。Bax可以转移到线粒体并在线粒体外膜上形成孔隙，过量的APAP可导致膜间蛋白Smac和AIF的释放。如图4-F、G所示，与对照组比较，模型组胞质中AIF和Smac蛋白表达水平均显著升高（＜0.05），Bax蛋白表达水平显著降低（＜0.05）；而APAP联合儿茶素组以上蛋白表达水平均显著回调（＜0.05）。Mfn2和Drp1蛋白参与线粒体融合和分裂，在肝毒性过程中可以控制JNK的激活并影响氧化应激。如图4-H、I所示，与对照组比较，模型组线粒体中Mfn2蛋白表达水平显著降低（＜0.05），Bax和Drp1蛋白表达水平显著升高（＜0.05）；而用儿茶素处理则显著回调以上蛋白表达（＜0.05）。以上结果表明儿茶素可以预防APAP诱导的线粒体功能紊乱。

A-L02细胞给予15 mmol·L−1 APAP孵育0、6、12、18、24 h，检测ATP浓度；B-L02细胞给予40、80 μmol·L−1儿茶素，15 min后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测ATP浓度；C、D-L02细胞给予40、80 μmol·L−1儿茶素，15 min后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测线粒体膜电位变化；E-L02细胞给予40、80 μmol·L−1儿茶素，15 min后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测线粒体呼吸链复合物I活性；F～I-L02细胞给予40、80 μmol·L−1儿茶素，15 min后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测胞质Bax、Smac、AIF和线粒体Mfn2、Drp1、Bax蛋白表达；与对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01。

3.5 儿茶素抑制APAP诱导的L02细胞中JNK蛋白的磷酸化

首先考察L02细胞给予APAP孵育不同时间点对JNK蛋白磷酸化的影响。如图5-A、B所示，APAP（15 mmol/L）孵育6 h，JNK蛋白的磷酸化水平最高（＜0.05）。接下来考察儿茶素对APAP诱导的L02细胞中JNK蛋白磷酸化的影响。如图5-C、D所示，儿茶素预处理显著降低了p-JNK的表达（＜0.05）。表明儿茶素预处理降低了APAP诱导的L02细胞p-JNK蛋白的表达。

A、B-L02细胞给予15 mmol·L−1 APAP分别孵育0、0.5、1、3、6、12、24 h，检测p-JNK、JNK蛋白表达；C、D-L02细胞给予40、80 μmol·L−1儿茶素，15 min后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测p-JNK、JNK蛋白表达；与对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05。

3.6 JNK激活剂茴香霉素减弱儿茶素对肝细胞的保护作用

为了进一步证实儿茶素对JNK通路活性的影响，本研究使用JNK激活剂茴香霉素对细胞进行干预[18]。先将细胞用JNK激活剂茴香霉素（5、15 nmol/L）孵育15 min，再用儿茶素（40、80 μmol/L）孵育15 min，然后再加入APAP孵育6 h。如图6-A所示，15 nmol/L茴香霉素显著增加了p-JNK的蛋白表达（＜0.05）。如图6-B所示，与模型组比较，儿茶素组p-JNK蛋白表达水平显著降低（＜0.05）；而给予JNK激活剂后，p-JNK蛋白表达水平显著升高（＜0.05）。为了探讨儿茶素对茴香霉素处理的L02细胞的保护作用，对细胞活力进行测定。如图6-C所示，APAP（15 mmol/L）显著降低细胞活力（＜0.05），儿茶素预处理后能够显著回调细胞活力（＜0.05）。在加入茴香霉素后，细胞活力显著降低（＜0.05）。以上结果表明，JNK信号通路是儿茶素拮抗APAP诱导的肝损伤的关键所在。

3.7 茴香霉素减弱儿茶素对线粒体的保护作用

为检测JNK激活剂茴香霉素对线粒体功能的影响，对ATP含量、线粒体膜电位、线粒体呼吸链复合物I活性、胞质中Smac、AIF、Bax以及线粒体中Mfn2、Drp1、Bax蛋白表达进行检测。如图7所示，茴香霉素显著逆转了儿茶素对ATP含量、线粒体呼吸链复合物I活性、线粒体膜电位、胞质中Smac、AIF、Bax以及线粒体中Mfn2、Drp1、Bax蛋白表达的调控作用（＜0.05、0.01）。以上结果表明儿茶素可以通过抑制JNK信号通路来减轻APAP诱导的线粒体损伤。

A-L02细胞给予JNK激活剂茴香霉素（5、15 mmol·L−1）孵育15 min，再加入15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测p-JNK、JNK蛋白表达；B-L02细胞给予15 mmol·L−1茴香霉素孵育15 min，再给予80 μmol·L−1儿茶素孵育15 min，然后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测p-JNK、JNK蛋白表达；C-L02细胞给予15 mmol·L−1茴香霉素孵育15 min，再给予80 μmol·L−1儿茶素孵育15 min，然后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测细胞活力；与对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05；与APAP＋儿茶素组比较：▲P＜0.05。

4 讨论

ALT和AST主要存在于肝细胞中[19]。如果肝脏受到损伤，血液中ALT和AST活性会急剧升高。因此，ALT和AST被认为是急性肝损伤的标志物[20]。在本研究中，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性均显著升高，并导致肝脏发生严重的组织病理学变化。给予儿茶素后，呈剂量相关性地降低了血清ALT和AST活性。表明儿茶素在APAP诱导的小鼠急性肝损伤中具有显著的保肝作用。

当摄入过量APAP时，会引起CYP450酶被激活，产生反应性代谢产物-乙酰基-对苯并醌亚胺（-acetyl-para-amino-phenol，NAPQI）[21-22]。CYP450在APAP肝毒性中起关键作用是由于CYP450的几种亚型如CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4参与APAP代谢[17]。因此，本研究探究了儿茶素对CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4酶活性的影响。结果表明，100 μmol/L儿茶素仅能抑制CYP3A4的活性，对CYP2E1、CYP1A2没有影响。这说明抑制APAP的代谢酶只是儿茶素减轻肝毒性机制的一小部分。

大量研究表明，线粒体氧化应激是APAP诱导肝损伤的重要因素[23]。氧化应激的产生是体内氧化和抗氧化作用的失衡[24]。儿茶素可通过提高GSH水平和SOD活性，降低ROS水平，从而发挥保肝作用。氧化应激中会产生过量的ROS和自由基[25]。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂[26]。SOD的作用机制主要是清除对身体有害的超氧阴离子和自由基[27]。在本研究中，观察到肝损伤小鼠体内GSH水平和SOD活性较低，ROS水平升高，而经儿茶素处理后显著降低了GSH和SOD的消耗以及ROS的水平。这表明儿茶素的保肝作用与其抗氧化能力有关。

ATP是生物体内能量转化最基本的载体，其含量的变化直接关系到各器官的能量代谢[28]。线粒体可以从产生ATP的分解代谢细胞器转变为产生ATP的合成代谢细胞器[29]。因此，线粒体是细胞ATP最有效的来源。线粒体功能障碍是由细胞凋亡过程中ATP水平的改变和线粒体膜电位下降所引起的[30]。研究表明，儿茶素可以通过改善线粒体功能和生物能量学来预防线粒体功能障碍和有氧能量代谢的受损[31]。本研究结果表明，儿茶素预处理不仅提高了ATP水平，还恢复了线粒体膜电位，降低了与线粒体损伤相关的凋亡相关蛋白如AIF和Bax的表达。

A-L02细胞给予15 mmol·L−1茴香霉素孵育15 min，再给予80 μmol·L−1儿茶素孵育15 min，然后给予15 mmol·L−1 APAP孵育6 h，检测ATP含量；B-线粒体呼吸链复合物I活性；C、D-线粒体膜电位；E～H-胞质Bax、Smac、AIF和线粒体Mfn2、Drp1、Bax蛋白表达；与对照组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与APAP＋儿茶素组比较：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01。

线粒体呼吸链复合体是线粒体内膜中电子传输链的重要组成部分[32]。线粒体呼吸链复合物I活性的降低会影响电子传输并增加ROS水平，导致线粒体功能障碍[33]。研究表明，APAP会干扰线粒体呼吸链复合物的形成，导致ATP水平下降、ROS活性增加，从而引起肝损伤[34]。本结果表明儿茶素预处理增加了线粒体呼吸链复合物I的活性。因此，恢复线粒体呼吸链复合物I的活性可能是治疗APAP诱导的急性肝损伤的有效方法。

JNK信号通路的激活被认为是APAP诱导的肝损伤的重要机制[35]。ROS可激活JNK信号通路，增加线粒体膜通透性。ROS的产生和JNK的激活形成了正反馈循环，因此会增加氧化性损伤[36]。先前的研究表明，JNK的激活可导致Bax激活并易位到线粒体，并在线粒体外膜中形成孔隙，然后引起线粒体膜间蛋白Smac和AIF释放，导致DNA断裂[37-39]。本研究结果表明，在APAP处理的肝细胞中，p-JNK水平显著升高，而儿茶素的保护作用在JNK激活剂处理后显著减弱。这说明儿茶素对JNK的抑制作用在APAP诱导的肝损伤中至关重要。

综上，本研究表明儿茶素在体内外均能抑制APAP诱导的肝损伤。在体内，儿茶素可以降低ALT和AST活性，减少肝组织损伤，并增加肝脏GSH水平和SOD活性，从而降低氧化应激；在体外，儿茶素可以提高人肝细胞的存活率以及线粒体中膜电位、线粒体呼吸链复合物I活性和ATP水平。进一步的研究结果表明儿茶素对肝损伤的保护作用与其对JNK的抑制有关。目前的文献多是对儿茶素类化合物如表儿茶素、EGCG[40]等化合物保肝作用的研究，对儿茶素的保肝作用研究鲜有报道，本研究从体内外系统阐释了儿茶素拮抗APAP的肝损伤的作用，并利用信号分子抑制剂对其保肝机制进行了较为深入的研究。但由于条件限制未在转基因动物上进一步验证，这也将是后续的研究内容之一。本研究为儿茶素的保肝作用提供了实验依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Mechanism of catechin on antagonizing acetaminophen-induced liver injury based on JNK signaling pathway and mitochondrial oxidative stress

SUN Wuyan, ZHANG Juan, ZHANG Xuan, WANG Chunbao, PENG Qiuling, BAI Qingyun

School of Chemistry and Bioengineering, Yichun University, Yichun 336000, China

To explore the effect and mechanism of catechin on acetaminophen (APAP)-induced liver injury based on c-Jun-terminal kinase (JNK) signaling pathway.ICR mice were randomly divided into control, model and catechin (50, 100 mg/kg) groups. The mice were given catechin for three consecutive days through intragastric administration, and after the last dose of catechin for 1 h, mice were ip APAP (400 mg/kg). After 6 h, hematoxylin-eosin (HE) staining was used to evaluate liver tissue lesions in mice. The activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum, as well as the level of glutathione (GSH) and activity of superoxide dismutase (SOD) in liver were detected. The effect of catechin on activity of cytochrome P450 (CYP450) metabolic enzymes was observed. Normal human liver cells L02 were given 40 and 80 μmol/L catechin, incubated with 15 mmol/L APAP for 6 h after 15 min, reactive oxygen species (ROS) level, changes in mitochondrial membrane potential, mitochondrial respiratory chain complex I activity, adenosine triphosphate (ATP) content, protein expressions of cytoplasmic B-cell lymphoma-2 associated X protein (Bax), second mitochondrial derived activator of caspases (Smac), apoptosis inducing factor (AIF), as well as mitochondrial dynamin-related protein 1 (Drp1), mitofusin 2 (Mfn2), Bax, and p-JNK, JNK were detected. After administering JNK activators, the effect of catechin on APAP-induced liver cell damage was investigated.Catechin significantly reduced the activities of ALT and AST in serum of APAP-induced liver injury mice (< 0.05, 0.01), significantly increased GSH level and SOD activity in liver (< 0.05, 0.01), and improved liver injury. Catechin significantly increased the survival rate, mitochondrial membrane potential, mitochondrial respiratory chain complex I activity and ATP level of L02 cells treated with APAP (< 0.05, 0.01), significantly reduced ROS level (< 0.05), significantly downregulated the protein expressions of Drp1, Bax in mitochondria and Smac, AIF in cytoplasm (< 0.05), significantly upregulated the protein expressions of Mfn2 in mitochondria and cytoplasmic Bax (< 0.05), and inhibited the phosphorylation level of JNK (< 0.05). After administering JNK activators, the antioxidant and liver protective effects of catechins were significantly reduced (< 0.05, 0.01).Catechin alleviates mitochondrial oxidative stress by inhibiting JNK signaling pathway, thereby antagonizing APAP induced liver injury.

catechin; acetaminophen; liver injury; mitochondrial oxidative stress; JNK signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2024)08 - 2589 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.010

2023-11-25

国家自然科学基金资助项目（81960748）；江西省教育厅科技项目（GJJ211640)

孙武燕，硕士研究生，研究方向为药物性肝损伤及中药的保肝活性。E-mail: 1060798172@qq.com

张 娟，硕士研究生，研究方向为药物性肝损伤及中药的保肝活性。E-mail: 2103840739@qq.com

通信作者：白庆云，教授，研究方向为药物性肝损伤及中药的保肝活性。E-mail: baiqingyun@163.com

[责任编辑 李亚楠]