黄璐晗,尹小庆,阚建全,武运,戚晨晨,彭芸,SAMEH Awad,AMEL Ibrahim,杜木英*
1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)2(西南大学中匈食品科学合作研究中心,重庆,400715)3(川渝共建特色食品重庆市重点实验室,重庆,400715)4(西藏自治区农牧科学院农产品开发与食品科学研究所,西藏 拉萨,850032)5(新疆农业大学 食品科学与药学学院,新疆 乌鲁木齐,830000)6(新疆新康农业发展有限公司,新疆 乌鲁木齐,830000)7(亚历山大大学 农学院,埃及 亚历山大,999060)
鲊辣椒是一种传统的发酵食品,在湖北、云南、贵州、四川和中国其他地区受到越来越多公众的认可和青睐[1]。它通常是以谷物(主要是玉米或大米)和新鲜红辣椒为原料,经过自然发酵生产的。首先,将原料粉碎并与适量的水和食盐混合。随后,将充分混合的原料放入发酵罐中,在阴凉处进行厌氧发酵,整个发酵周期需在室温下持续30~60 d。经过厌氧发酵后,制得具有酸、香、辛、鲜味等特点的鲊辣椒,可在烹饪后食用,也可作为调味品添加到食品中[2]。
目前,研究人员对鲊辣椒发酵过程中的优势菌群和微生物的变化规律有一定的了解[2-4],对鲊辣椒的工艺优化也从菌种、原料、发酵条件等多方面入手,鲊辣椒的营养物质、功能成分、风味品质的研究也逐渐增多[5]。但目前鲊辣椒的工业生产存在发酵周期长、生产效率低、发酵成功的鲊辣椒品质不一等问题,微生物接种发酵技术是缩短发酵周期和改善产品品质的有效途径之一。有研究发现接种发酵可以保证泡菜质量的稳定性、明显地缩短其发酵周期[6]。生香酵母又称产香酵母或产酯酵母,是一类以代谢主要生成酯类物质,同时能促进醇、酮、醛、酚、烯等挥发性风味物质产生的微生物[7],对发酵制品的风味品质有较大的提升作用。因此,运用产香酵母来研究鲊辣椒发酵工艺具有一定的实用价值和意义。
因此本文将在实验室前期研究的基础上[8-9],运用植物乳植杆菌XZ3和毕赤酵母菌Y50混合发酵制作鲊辣椒,拟采用模糊数学感官综合评价法,在单因素试验的基础上,以混合发酵鲊辣椒的综合感官评分为响应值,通过响应面优化试验确定鲊辣椒混菌发酵的最佳工艺条件,并测定其功能性成分,以期为鲊辣椒混菌发酵的开发和生产提供一定的参考。
新鲜小米椒、生玉米粉、腌制盐,重庆北碚永辉超市;植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)XZ3,实验室前期从自然发酵鲊辣椒中筛选所得,保存于西南大学食品科学学院;生香酵母菌Y50,实验室前期从自然发酵鲊辣椒中筛选所得,经鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)Y50,保存于西南大学食品科学学院。YPD液体培养基、MRS液体培养基,青岛海博生物科技有限公司;亚硝酸钠(分析纯)、3,5-二硝基水杨酸(分析纯)、甲醇(色谱纯),成都科龙化工试剂厂;多酚组分、辣椒碱标准品,索莱宝生物科技有限公司。
WZT-1M细菌浊度仪,上海劲佳科学仪器有限公司;B302生物显微镜,重庆奥特光学仪器有限责任公司;HPX-9025 MBE电热恒温培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;HZ-9211K恒温振荡器,太仓市科教器材厂;5810离心机,德国Eppendorf公司;pHS-3C pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;LC-20高效液相色谱仪,日本岛津公司;L-8900全自动氨基酸分析仪,日本日立公司。
1.3.1 鲊辣椒制作工艺流程
新鲜红辣椒→清水冲洗干净→晾干→破碎→加入食盐、等重的生玉米粉、少量水→接种→装罐→发酵→成品
操作要点:
①辣椒处理:将新鲜小米椒摘除蒂柄,清水冲洗3次,在自然通风处晾干并计量质量,用料理机破碎(大小不超过2 mm×2 mm)。
②拌料:加入质量分数4%的食盐、等质量的生玉米粉、少量的水,以捏可成团松即散开为宜。
③接种:XZ3发酵液:活化培养后调节其浓度至3×108CFU/mL;Y50发酵液:活化培养后通过血球计数板计数将浓度调节为107CFU/mL,将XZ3和Y50的菌体发酵液按比例混匀,然后将此混合发酵液接入拌好的基料中。
④发酵:将其装入罐内,恒温发酵,即得鲊辣椒成品。
1.3.2 鲊辣椒发酵工艺优化单因素试验
为确定响应曲面优化法试验的各因素与水平,选取植物乳植杆菌XZ3与生香酵母菌Y50的配比、混菌接种量、食盐添加量和发酵时间4个因素分别进行单因素试验,依次考察XZ3与Y50的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3,体积比)、混菌接种量(0、1%、2%、3%、4%、5%)、食盐添加量(2%、3%、4%、5%、6%,质量分数)、发酵时间(0、2、4、6、8 d)对混菌发酵鲊辣椒感官评分的影响。
1.3.3 响应面优化试验
以XZ3和Y50的混菌比例(A)、混菌添加量(B)、食盐添加量(C)及发酵时间(D)作为主要影响因素,以模糊综合感官评分为响应值,采用响应面法进行中心组合设计[10]试验,因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken设计试验因素水平Table 1 Factors and levels in the Box-Behnken design
1.3.4 理化指标的测定
参照GB/T 10468—1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》;总酸的测定参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》进行。
1.3.5 模糊综合感官评价
1.3.5.1 感官评价
由10名(5男、5女)食品专业研究生组成评定小组,根据表2鲊辣椒感官评定表进行评定[11]。开始评定的前60 min内,不沾烟酒等刺激性强的食品。两样品之间吃适当的苏打饼干,并以清水漱口,间隔5 min。
表2 鲊辣椒感官评定表Table 2 Sensory evaluation table of Zha-chili
1.3.5.2 模糊数学模型的建立
评定因素集U={u1,u2,u3,u4},u1、u2、u3、u4分别表示色泽、质地、滋味、香气。评语集V={v1,v2,v3},v1、v2、v3分别对应易接受(8~10分)、一般接受(4~7分)、难接受(0~3分)。各因素的权重分别为色泽(0.12)、质地(0.18)、滋味(0.40)、香气(0.30),记为A={a1,a2,a3,a4}=(0.12,0.18,0.40,0.30)。综合评价结果Ri=A·Bi,其中Bi为转换矩阵,感官评分Si=Ri·V。
1.3.6 三种鲊辣椒的制备方法
将新鲜红辣椒摘除蒂柄,清水冲洗3次,在自然通风处晾干并计量质量,用料理机破碎(大小不超过2 mm×2 mm)。加入质量分数4%的食盐、等质量的生玉米粉、少量的水,以捏可成团松即散开为宜。将其装入罐内不盖严,30 ℃下自然发酵6 d,得ZN;将质量分数2.5%植物乳植杆菌XZ3发酵液均匀接入拌好的基料中,其余步骤均相同,得ZP;按上述优化得到的鲊辣椒混菌发酵工艺接种制得ZM。
1.3.6.1 鲊辣椒中辣椒碱含量的测定
参照GB/T 21266—2007《辣椒及辣椒制品中辣椒素类物质测定及辣度表示方法》处理样品。色谱条件:色谱柱Thermo C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);进样量20 μL;流动相为V(甲醇)∶V(水)=80∶20;流速0.8 mL/min;柱温40 ℃;检测波长281 nm。采用外标法对鲊辣椒中的辣椒素及二氢辣椒素进行定量。
1.3.6.2 鲊辣椒总酚和黄酮含量的测定
游离酚的提取[12]:称取2.5 g鲊辣椒,与25 mL体积分数80%的丙酮混匀,冰浴条件下均质,离心(3 500 r/min,10 min),保留上清液,残渣重复离心2次,混合所有的上清液并抽滤,滤液在45 ℃真空旋转蒸发至原体积的10%左右,再用纯水定容至25 mL,置于-40 ℃备用。
结合酚的提取[13]:将上述残渣和25 mL 2 mol/L 的NaOH溶液混合,避光分解1.5 h。将pH值调至2。加入25 mL乙酸乙酯,在黑暗条件下搅拌10 min,离心(3 500 r/min,10 min),取上清液,重复3次。将得到的上清液在45 ℃下蒸干后置于10 mL容量瓶中,用纯水定容,置于-40 ℃备用。
总酚的测定:参照HUANG等[14]描述的用Folin-酚测定总酚含量。总酚含量以每100 g鲊辣椒中所含没食子酸当量(gallicacid equivalant,GAE)表示(以干质量计),即mg GAE/100 g。
总黄酮的测定:参照LIU等[15]的方法,吸取0.5 mL 1.3.6.2节中游离酚类提取液于试管中,与0.15 mL质量分数为5%的 NaNO2溶液和2 mL H2O混合,静置5 min,再与0.15 mL质量分数为10% 的AlCl3溶液混和,静置10 min,吸取1 mL NaOH(1 mol/L)溶液,静置10 min,510 nm处测定吸光度值。总黄酮以每100 g鲊辣椒中所含芦丁当量表示,即mg芦丁/100 g。
1.3.6.3 鲊辣椒中多酚组分的测定
样品提取:参照1.3.6.2节中游离酚和结合酚的提取。色谱条件:色谱柱Thermo C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相条件:A相为质量分数0.2%甲酸,B相为乙腈;流速0.7 mL/min;进样量20 μL;柱温40 ℃;检测波长280 nm。梯度洗脱程序:0~5 min,90% A;5~50 min,60% A;50~60 min,90% A;60~65 min,10% A。
1.3.6.4 鲊辣椒中氨基酸含量的测定
采用氨基酸全自动分析仪测定鲊辣椒中游离氨基酸种类和含量。
每个实验重复3 次,结果以平均值±标准差表示。使用Origin 2022作图,SPSS 25.0 进行统计和方差分析,Design-Expert 8.0.6进行响应面分析。
不同发酵时间感官评价结果见表3,其余因素的鲊辣椒样品均以发酵时间为例,通过模糊评判计算得到最终感官评分。
表3 不同发酵时间鲊辣椒感官评定Table 3 Sensory evaluation results of Zha-chili at different fermentation time
由表3可知,在 10名品评人员对发酵时间 0、2、4、6、8 d 的鲊辣椒的色泽、质地、滋味和香气的评价结果得到评价矩阵B0d、B2d、B4d、B6d、B8d。综合评判结果R0d=A·B0d,以此类推得单因素发酵时间的所有水平的综合评判结果如下:
同理可得:R2d=(0.088,0.524,0.388);R4d=(0.722,0.248,0.03);R6d=(0.732,0.238,0.03);R8d=(0.624,0.336,0.04)。
计算评分时,令v1=9,v2=6,v3=3。得出感官综合评分如下:
同理得:Y2d=5.10;Y4d=7.18;Y6d=8.11;Y8d=7.75。
参照发酵时间的评判方法,计算其他3个因素的模糊综合感官评分,即混菌比例:Y3∶1=4.57、Y2∶1=5.30、Y1∶1=7.79、Y1∶2=6.07、Y1∶3=5.06;混菌添加量:Y0=5.11、Y1%=7.12、Y2%=8.17、Y3%=6.44、Y4%=4.63、Y5%=4.32;食盐添加量:Y2%=5.10、Y3%=7.13、Y4%=8.27、Y5%=6.55、Y6%=4.63。
2.2.1 混菌配比的确立
由图1-a可知,不同的菌种配比对混菌发酵鲊辣椒的色泽、质地、滋味和香气有较大的影响,当XZ3和Y50的配比为1∶1时,其接受度相对最高,感官评分达到了最大分,为7.79分,此时总酸含量最高,为0.91 g/100 g。说明这两种混菌比例为1∶1时,鲊辣椒的品质最好。所以选取两菌比例1∶1为最佳比例。
a-混菌配比;b-混菌添加量;c-食盐添加量;d-发酵时间图1 发酵条件对鲊辣椒的影响Fig.1 Effect of fermentation conditions on physicochemical properties and sensory qualities of Zha-chili注:组别间字母不同表示差异显著(P<0.05),相同代表差异不显著(下同)。
2.2.2 混菌添加量的确立
由图1-b可知,菌种添加量从0增至2%的过程中,感官评分持续升高,当不添加菌种时,鲊辣椒呈暗红色、无光泽、无浓郁的香气。当菌种添加量为2%时,感官评分最高,此时的鲊辣椒具有特有的酸味和醇香味,香气浓郁,质地均匀,且颜色鲜亮、具有光泽、酸辣适口、咸淡合适。菌种添加量由2%增至5%的过程中,感官评分呈现下降的趋势,菌种添加量过多,导致鲊辣椒酸味和醇香味太强,香气刺鼻,影响口感,且质感较差,没有光泽。随着菌种添加量的增加,pH值呈现下降的趋势,总酸含量不断增加。从接受度上看,当混菌接种量为2%时的鲊辣椒最受欢迎。所以选取混菌接种量2%为最佳条件。
2.2.3 食盐添加量的确立
由图1-c可知,随着食盐添加量的增加,鲊辣椒的感官评分出现先上升后下降的趋势,而总酸含量则持续下降。这可能是由于食盐添加量越多,对发酵菌的抑制作用越强,故其发酵产酸则越少,同时也抑制了水解酶的活性。当食盐添加量为4%时,感官评分达到了最大分,为8.27分,此时人们的接受度最高。这是由于当食盐添加量过少时,鲊辣椒味道过淡,且发酵过程中易被杂菌污染,造成鲊辣椒的整体品质下降;当食盐添加量过高,易造成鲊辣椒过咸,口感不适。因此选取4%食盐添加量为最适盐度。
2.2.4 发酵时间的确立
由图1-d可知,在发酵前6 d时,总酸含量显著升高、pH值显著下降。当发酵时间达到第6天时,鲊辣椒总酸含量为1.39 g/100 g,pH值为4.03,之后的鲊辣椒中总酸含量的增加趋于平缓。此外,随着发酵时间的增加,鲊辣椒的感官评分呈现整体上升的趋势。发酵0 d的鲊辣椒让人难接受,发酵后的鲊辣椒接受度变高。推测原因为新鲜辣椒的主要风味物质以醛类和醇类为主,烯烃、烷烃类次之,酯类物质较少,而随着发酵的进行,鲊辣椒中的烷烃类物质减少,而酯类和萜类物质上升[16],香气更佳,使鲊辣椒的整体品质得到了提升。在发酵时间为6 d时感官评分最高,为8.11分,所以选取发酵6 d为最佳发酵时间。
响应面试验结果及分析请见电子版增强出版附表1、附表2和附图1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035754),用回归模型预测的鲊辣椒最佳发酵工艺条件为植物乳植杆菌XZ3与生香酵母菌Y50的比例为1∶1.12,混菌添加量2.55%、食盐添加量3.96%、发酵时间6.02 d,此时感官评分预测值为8.46分。考虑实际情况,将最佳条件修正为植物乳植杆菌XZ3与生香酵母菌Y50的比例为1∶1、混菌添加量2.5%、食盐添加量4%、发酵时间6 d,此时鲊辣椒得分为8.45分,与预测值接近。综上所述,该工艺的最佳条件试验结果可靠。
2.4.1 感官评价结果分析
不同发酵方式的鲊辣椒的感官评分如图2可知,混菌发酵的鲊辣椒的整体感官评分最高,为8.43,而自然发酵鲊辣椒的感官评分仅为6.32,分析其原因可能是未接菌自然发酵鲊辣椒中微生物活性较低,在短暂的发酵时间内不能产生大量的香气物质,造成其香气、滋味等感官评分较低。而与纯种发酵鲊辣椒ZP相比,ZM的色泽和香气得分更高,这与混菌发酵鲊辣椒中含有更多的挥发性物质有关,赋予了鲊辣椒更浓郁的酯香、花香和果香[9]。此外,蔬菜发酵过程中,微生物生长及生理生化变化是导致发酵过程中色泽变化的重要因素[17]。与ZN和ZP相比,ZM的色泽显著提升,可能是XZ3和Y50的加入缩短了鲊辣椒的发酵时间,使其成品在短时间内颜色鲜艳、具有光泽。
图2 不同发酵方式鲊辣椒的感官评分雷达图Fig.2 Sensory score radar chart of Zha-chili produced by different fermentation methods注:ZN-不接菌自然发酵鲊辣椒;ZP-植物乳植杆菌XZ3纯种发酵鲊辣椒;ZM-优化条件下的混菌发酵鲊辣椒(下同)。
2.4.2 理化指标含量分析
鲊辣椒中的微生物发酵产酸,导致pH值下降,总酸含量上升,合适的pH和酸度不仅可以影响微生物的活动,还能抑制有害微生物的生长从而延长货架期[18]。3种鲊辣椒的pH及总酸含量的差异如图3所示,市售鲊辣椒的pH值通常在3.94~4.53,本研究所测得的3种鲊辣椒均处于此pH范围,ZM与ZP的pH值和总酸含量无显著性差异(P>0.05),但其pH值显著低于ZN,总酸含量显著高于ZN(P<0.05)。其原因可能是接种发酵的鲊辣椒样品中微生物活动较强,大量的微生物生长繁殖将还原糖转化为总酸,导致其含量升高,pH值下降[19]。
图3 不同发酵方式鲊辣椒的pH及总酸含量的差异Fig.3 Differences in pH and total acid content of Zha-chili produced by different fermentation methods
2.4.3 辣椒碱含量分析
辣椒碱是辣椒产生的一类次级代谢产物,主要从氨基酸衍生而来,在辣椒碱合成酶等一系列酶的作用下合成[20]。辣椒素类物质决定了鲊辣椒的辣味,且具有多种生理功能,不仅可以降血压、降胆固醇、预防心脏病等,还可以作为一种安全药物用于治疗色素沉着过度,其具有潜在的皮肤病学应用前景[21]。由图4可知,混菌发酵鲊辣椒中辣椒碱的含量最高,为(0.43±0.02) mg/g,显著高于纯种发酵鲊辣椒中辣椒碱的含量(P<0.05),但与自然发酵鲊辣椒中辣椒碱含量差异不显著(P>0.05)。这说明,辣椒碱含量与发酵过程中微生物的种类和含量有密切关系,这可能是由于辣椒素的合成是由多基因参与调控的并且受发酵环境的影响[22]。
图4 不同发酵方式鲊辣椒中辣椒碱含量的差异Fig.4 Differences of capsaicin content in Zha-chili by different fermentation methods
2.4.4 鲊辣椒总酚和总黄酮的含量分析
多酚中酚羟基有良好的自由基清除能力,为酚酸类物质带来抗氧化、抗菌、抗病毒等多种生物活性,在预防癌症、心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症、神经性病变及抗炎和抗菌等方面有重要的作用[23]。葛平珍等[24]的研究表明鲊辣椒前15 d的发酵过程中游离型多酚、结合型多酚以及总酚含量均增加。从表4可知,3种鲊辣椒中的游离型和总多酚含量均无显著性差异(P>0.05),但ZM中的结合型多酚的含量显著低于ZN和ZP(P<0.05)。从黄酮含量分析,ZM中游离型黄酮含量显著低于ZN和ZP(P<0.05),但是结合型黄酮显著高于ZN和ZP(P<0.05)。辣椒中的黄酮类化合物主要是槲皮素和木犀草素,由于乳酸菌的作用可促进辣椒中的黄酮类物质溶出[25],因此,ZM及ZP中的总黄酮含量显著高于ZN(P<0.05)。综上可知,添加生香酵母Y50的ZM并未提升多酚的含量,但是对于黄酮的含量有一定的影响。
表4 不同发酵方式鲊辣椒中多酚类及黄酮类物质含量的差异Table 4 Differences of polyphenols and flavones content in Zha-chili by different fermentation methods
2.4.5 鲊辣椒多酚成分的分析
辣椒中含有多种酚类物质,本研究主要检测的多酚类物质共计10种。如表5所示,3种鲊辣椒中的酚类和黄酮类物质分别检出6种、5种和7种。ZM中多酚组分含量最高,为(819.82±3.68) mg/kg,比ZN和ZP分别高15.1%和6.8%。绿原酸由奎尼酸与咖啡酸缩合而成,其抗氧化能力强于阿魏酸、咖啡酸、生育酚等物质,在机体中主要通过微生物作用,在结肠或小肠中被水解吸收,其主要代谢产物为咖啡酸、阿魏酸、p-羟基酸[26]。ZN和ZM中绿原酸、阿魏酸的含量无显著性差异(P>0.5),而在ZP中含量最高。芦丁又名维生素P,氧自由基清除能力远强于维生素E,研究发现,ZM中的芦丁含量显著高于ZN,低于ZP。杨梅素及其苷类在抗癌、抗氧化、抗糖尿病等活性方面比槲皮素、山奈酚等其他26种黄酮类化合物表现出更强的活性[27]。ZP和ZM中均检出了杨梅素,而ZN未检出。综合分析,ZM中多酚组分含量最高且种类检出最多,比ZN和ZP表现更佳。
表5 不同发酵方式鲊辣椒中多酚组分含量的差异Table 5 Differences of polyphenols content in Zha-chili by different fermentation methods
2.4.6 鲊辣椒氨基酸的含量分析
氨基酸是蛋白质的组成部分,在人体营养和生理上有重要作用。如表6所示,ZM中氨基酸总量、必需氨基酸含量与ZN无显著性差异(P>0.05),但是比ZP分别高出了581.19 mg/kg和203.48 mg/kg。苦味氨基酸含量在3种鲊辣椒中分别占氨基酸总量的45.3%,43.5%和42.8%,可见ZM中苦味氨基酸的比例降低,且ZM中的甜味氨基酸含量分别高出ZN和ZP的23.9%和20.7%。虽然ZM中的鲜味氨基酸含量显著低于ZN(P<0.05),但比ZP中的鲜味氨基酸含量高72.06 mg/kg。3种鲊辣椒中含量最高的必需氨基酸为Leu,Leu可提高肌肉蛋白质的代谢,促进肌肉蛋白质和骨骼肌蛋白质的合成[28],而ZM中Leu的含量显著高于ZP(P<0.05)。ZM中Glu含量显著上升,Thr、Gly的含量均高于ZN和ZP。综合分析,添加生香酵母的ZM甜味氨基酸的含量上升,苦味氨基酸的比例降低。与ZP相比,氨基酸的总量和必需氨基酸的含量上升,同时鲜味氨基酸的含量也增加了。
表6 不同发酵方式鲊辣椒中氨基酸含量的差异Table 6 Differences of amino acid content in Zha-chili by different fermentation methods
本试验以小米椒和生玉米粉为原料,以植物乳植杆菌XZ3和生香酵母菌Y50为菌种,制作一款混菌发酵鲊辣椒,采用模糊数学感官评定法结合响应面法优化得到混菌发酵鲊辣椒的最佳生产工艺条件:植物乳植杆菌XZ3与生香酵母菌Y50的比例为1∶1、混菌添加量为2.5%、食盐添加量为4%、发酵时间6 d。所得鲊辣椒模糊综合感官评分为8.45分,呈亮黄色,酸辣适口,具有鲊辣椒特有的酸味和醇香味。对以最佳工艺条件生产的鲊辣椒的功能性成分进行测定,与自然发酵鲊辣椒和利用植物乳植杆菌XZ3纯种发酵的鲊辣椒进行对比,发现混菌发酵鲊辣椒中多酚组分含量最高且种类检出最多,其总酸含量、辣椒碱含量及总黄酮含量均显著高于自然发酵鲊辣椒。同时,相比其他两种,混菌发酵鲊辣椒中甜味氨基酸的含量上升,苦味氨基酸的比例降低,说明混菌发酵鲊辣椒不仅能提升鲊辣椒的感官风味,还能提升其活性物质成分,为混菌发酵鲊辣椒的生产提供一定的参考和指导。