林下人参不同部位黄酮类成分分析

周晓敏，何霞红，施 蕊，李顺美，张靖仪*

（1.云南省林下资源保护与利用重点实验室，云南昆明 650224；2.西南林业大学园林园艺学院，云南昆明 650224）

人参是五加科人参属多年生草本植物，是植物界的活化石，自古便有“百草之王”的美称，被列为我国重点一级保护野生植物。经研究发现，人参在治疗心血管疾病、抗癌、抗肿瘤等方面均有明显作用[1]。人参的各部位都含有很多的化学成分，并且有很好的药性，因此当前对人参各部位的研究也越来越多。徐艳阳等研究表明，多酚含量最高的部位是人参叶，其次为茎和花，在根中的含量最低[2]。顾健等研究表明，人参皂苷20(R)-Rg2 在人参花中的含量较高[3]。WU等研究表明，人参花蕾中总皂苷含量高，用来泡水喝有提神抗疲劳和增强免疫力的作用[4]。姚丽娜等用人参根和人参茎叶皂苷溶液给单独饲养的小鼠灌胃，发现人参根皂苷具有中枢镇静的功效，而茎叶皂苷则有相反的功效，会使小鼠兴奋[5]。

黄酮类成分是天然药用植物中常见的化学成分之一，在治疗心血管疾病、抗病毒、抗肿瘤等方面有积极作用，尤其是在抗癌、防癌方面功效显著，因此黄酮类成分在临床医疗、食品、工业等领域具有广阔的应用前景[6-8]。人参中含有的黄酮类成分具有很高的药效。张儒等研究发现，人参根中总黄酮能够通过提高脑组织超氧化物歧化酶的活性来增强脑组织的抗氧化能力[9]。目前，人参化学成分的研究与应用更多的集中于根部，对地上部分的研究较少，而且对人参化学成分的研究主要集中于皂苷类，对人参不同部位黄酮类成分的研究相对较少。因此，笔者运用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术对林下人参不同部位黄酮类成分进行测定和分析，筛选出不同部位的差异代谢物，为人参各部位药用价值的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用林下4 年生人参样品采自辽宁省本溪县东营坊乡南营坊村林下人参种植基地（东经41°29 8、北纬124°7 25，海拔310 m），选取人参根（L4-R）、茎（L4-S）、叶（L4-L）共3 组样品，每组样品设置3 个生物学重复。

1.2 试验仪器和试剂

试验仪器：UPLC-MS/MS 仪，来源于赛默飞世尔科技公司；Scientz-100F 冻干机，来源于北京四环起航科技有限公司；Retsch MM400 研磨仪，来源于上海净信实业发展有限公司；0.22 μm pore size 微孔滤膜，来源于上海摩速科学器材有限公司；离心机；涡旋仪；三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP）。

试验试剂有甲醇（色谱纯，Merck）、乙腈（色谱纯，Merck）、标准品（BioBioPha/Sigma-Aldrich）、超纯水、0.1%甲酸、聚丙二醇。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备与提取

将人参根、茎、叶样品分别放到冻干机中真空冷冻干燥后用研磨仪研磨成粉末状，称取100 mg 粉末用1.2 mL70%甲醇提取液溶解，用涡旋仪每30 min 涡旋1 次，每次持续30 s，共涡旋6 次，充分混匀后，将混合液用离心机离心10 min，转速设置为12 000 r·min-1，吸取上清液，用微孔滤膜过滤样品，放到进样瓶中保存，用仪器UPLC-MS/MS 进行分析。

1.3.2 UPLC-MS/MS 检测条件

液相条件：使用色谱柱Agilent SB-C18（1.8 µm，2.1 mm×100.0 mm）进行色谱分离；以加0.1%甲酸的超纯水为流动相A 相，加0.1%甲酸的乙腈为B 相进行梯度洗脱。

质谱条件：采用三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP）进行质谱分析，系统配备ESI Turbo 离子喷雾接口，操作参数设置如表1 所示；在QQQ 和LIT模式下分别用10 μmol·L-1和100 μmol·L-1聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；碰撞气体（氮气）为中等。

表1 ESI 源操作参数

1.3.3 数据处理

基于自建数据库MWDB（Metware Database），根据二级谱信息对样品中黄酮类成分进行定性分析，运用三重四极杆线性离子阱质谱仪的多反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）对样品中黄酮类成分进行定量分析。用软件Analyst 1.6.3 进行质谱数据处理，用MultiaQuant 软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正。对不同质控（Quality Control，QC）样本，即混合样本质谱检测分析的总离子流图（Total Ions Current，TIC）进行重叠展示分析，根据TIC 图判断代谢物提取和检测的技术重复及可靠性。处理后的数据采用主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA）相结合的多元统计分析，筛选差异变量，运用R 软件中的MetaboAnalystR 包OPLSR.Anal 函数进行分析。

2 结果与分析

2.1 林下人参黄酮类成分的定性定量分析

用UPLC-MS/MS法检测得到多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式代谢物检测多峰图（见图1)，并基于自建数据库从人参根、茎、叶中共检测到92 种黄酮类代谢产物，包括黄酮醇41 种，黄酮化合物13 种，二氢黄酮11 种，花青素7 种，黄酮碳糖苷、异黄酮和查耳酮各5 种，二氢黄酮醇4 种，其他类黄酮1 种。

图1 MRM 模式代谢物检测多峰图

2.2 主成分分析

对样本进行主成分分析，初步了解人参根（L4-R）、茎（L4-S）、叶（L4-L）各样本组间的总体代谢差异和组内的变异度大小。PCA 得分图如图2 所示，图中每一个点表示一个样品，点与点之间的距离越远则表示差异性越大。由图2 可知，第一主成分（PC1）的贡献率为45.39%，第二主成分的贡献率（PC2）为41.18%，组内呈现相互聚集的情况，组间有区分，说明林下人参不同部位含有的黄酮类成分有所差异。OPLS-DA 模型验证如图3 所示，R2X=0.914，R2Y=0.982 和Q2=0.968，模型验证稳定可靠。

图2 L4-R_vs_L4-S_vs_L4-L_PCA 主成分分析图

图3 OPLS-DA 验证图

2.3 具体差异代谢物筛选

基于OPLS-DA 得到的结果，由表2 可知，从92种黄酮类代谢物中共筛选出27 种差异代谢物，其中黄酮醇12 种，黄酮化合物6 种，黄酮碳糖苷2 种，异黄酮2 种，二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、花青素和其他类黄酮各1 种。

表2 林下人参不同部位差异代谢物统计

对比27 种差异代谢物，进行进一步分析可知，(3R)-5,7-二羟基-6,8-二甲基'-3-(4'-羟基苄基)-色烷-4-酮、卷柏石松素、2,4,2',4'-四羟基-3'-异戊烯基查尔酮、柽柳苷、异柽柳苷、苜蓿素-4'-甲基醚-3'-O-葡萄糖苷、苜蓿素-7-O-葡萄糖二酸苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷(蔓菁苷)、泽兰黄酮-7-O-葡萄糖苷、6-甲氧基山奈酚-3-O-葡萄糖苷、万寿菊素-3-O-芸香糖苷、2'-羟基-5-甲氧基染料木素-4',7-O-二葡萄糖、牵牛花素-3-O-(6"-O-咖啡酰)葡萄糖苷共15 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为茎＞叶＞根；5,7,8,3',4'-五羟基-6-甲氧基氧杂蒽酮、异鼠李素-3-O-(6"-丙二酰)葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-(6"-没食子酰)半乳糖苷、madreselvin A 共5 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为根＞茎＞叶；4'-羟基-5,7-二甲氧基黄酮、金圣草黄素-8-C-葡萄糖苷-7-O-(6"-阿魏酰)葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷共4 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为叶＞根＞茎；芹菜素-7,4'-二甲醚和香橙素-7-O-葡萄糖苷2 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为叶＞茎＞根；柽柳黄素-3-O-(6"-丙二酰)葡萄糖苷在林下人参各部位的含量从高到低依次为茎＞根＞叶。

3 结论与讨论

人参中不同的黄酮类化合物具有不同的药理作用，在临床治疗方面都具备一定的功能价值。有关研究表明，异鼠李素在沙棘、银杏叶的研究较为广泛，是一种天然的小分子黄酮类化合物，也因其在抗癌、抗肿瘤以及心血管等方面有一定作用而用于临床治疗[11-14]。槲皮素可通过抑制肿瘤细胞的增殖、生长、侵袭、迁移，阻滞细胞周期，诱导其凋亡，同时降低耐药性[15]。天然的二氢黄酮具有抗癌、抗病毒等多种功能，但其在植物中含量较少，且提取困难，因此二氢黄酮人工化学合成在近几年备受关注[16]。查耳酮由于其促进抑癌基因表达、抑制肿瘤血管生成、抑制酪氨酸蛋白激酶表达，从而抑制细胞信号转导等多个抗癌机制在抗肿瘤领域引起广泛重视[17-18]。此外，将查耳酮与其他抗菌药效团结合形成的杂合体，具有耐药性低、活性高等优点，能成为新型抗菌药开发的潜在候选物[17-18]。苜蓿素安全性好，因此也广泛用于癌症治疗[19]。经研究发现，人参花黄酮在与其他类化合物的共同作用下，具有重要的抗疲劳、心血管保护、抗休克、抗肿瘤等功效[20-21]。崔福顺等以人参茎叶黄酮苷元为芯材，对人参茎叶微胶囊化进行了研究，为人参茎叶黄酮类化合物的研究和人参茎叶的应用提供了更多的可能性[22]。在前人研究中，西洋参根中发现有黄酮类化合物的存在，西洋参不同部位总黄酮含量测定结果显示为花＞果＞茎叶＞根[23-24]。李珂珂等从人参花蕾中首次分离出5 个苯丙酰基酰化黄酮醇苷类化合物，均为山柰酚的黄酮母核[25]。

近年来，人参的研究一直处于较高的水平，在临床应用方面也有着较高的研究价值[26-27]。2012 年，我国将人工种植的人参批准为新资源食品，自此之后人参也从单一的中药材扩展到食品加工以及保健产品等多个方面，为我国人参产业的发展创造了新的机会，提供了新的平台，因此对于人参功效及作用机理还需要更加深入和全面的研究。

此次研究通过超高效液相色谱-串联质谱技术分析了林下4 年人参根、茎、叶的黄酮类成分。此外，通过主成分分析法及正交偏最小二乘判别分析法对人参根、茎、叶中的黄酮类代谢物进行组间差异性和组内稳定性检测分析，并筛选出根、茎、叶中共有的黄酮类代谢物及3 者间有差异的代谢物。结果共检测到92 种黄酮类代谢物，包括41 种黄酮醇、13 种黄酮化合物、11 种二氢黄酮、7 种花青素、5 种黄酮碳糖苷、5 种异黄酮、5 种查耳酮、4 种二氢黄酮醇、1 种其他类黄酮；共筛选出27 种差异代谢物，其中15 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为茎＞叶＞根，5 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为根＞茎＞叶，4 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为叶＞根＞茎，2 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为叶＞茎＞根，1 种代谢物在林下人参各部位的含量从高到低依次为茎＞根＞叶。此次研究可为人参的综合利用提供更多的可能性，同时为推广林下人参栽培模式提供一定的理论依据。