精子相关参数与体外受精受精率的相关性研究*

黄玲,杨帆,江利,李苏萍

(郴州市第一人民医院生殖医学中心,湖南郴州423000)

据统计,大约有15%～20%的夫妇存在不孕不育,其中男性因素高达40%～50%[1-2]。造成男性不育的主要原因是精子质量下降,近年来,男性精子质量呈现不断下降的趋势[3-5]。在不孕不育高发的背景下,一些夫妇无法获得自然妊娠而选择辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)助孕治疗。精子功能不仅在自然生育中扮演了不可替代的角色,在体外受精(invitrofertilization,IVF)治疗中也起着非常关键的作用。目前评估男性生育潜能的指标多依据精子浓度、精子活力和正常形态精子百分率等精液常规分析指标[6]。研究显示精子DNA作为父系遗传信息的直接载体,对胚胎发育、妊娠结局及子代的安全性均有重要影响[7]。精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index,DFI)是反映精子完整性的关键指标,DNA损伤的精子即使能够正常启动受精和早期胚胎发育,但仍会导致流产等不良妊娠结局[8]。顶体酶是精子顶体区域非常重要的一种蛋白质水解酶,其能够溶解卵子表面的透明带,让精子核DNA顺利进入卵细胞中。相关研究显示,男性精子顶体酶活性与IVF受精率有相关性[9]。也有一些研究认为精子顶体酶活性、精子DFI、精子形态学分析等检测与体外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer,IVF-ET)临床结局不相关[10-14]。目前,国内外对IVF受精率的相关研究多是单因素分析,男方精液参数多因素对IVF受精率综合作用的评估研究较少。因此,本研究的目的在于探讨精子相关参数与IVF受精率的相关性,以提高患者辅助生殖的成功率。

1 资料与方法

1.1研究对象 以2020年4月至2023年4月在我院行IVF的327例男性为研究对象。纳入标准:(1)男方年龄22～50岁,配偶年龄小于40岁;(2)同居或婚后未避孕一年以上而未孕,因女方输卵管障碍首次来我院行IVF治疗;(3)双方性生殖器官及功能正常,无自身免疫病、遗传性疾病;(4)半年内未服用对检验结果有影响的药物;(5)女方采用早卵泡期长方案促排且获卵数≥3枚、卵母细胞成熟度≥50%。排除标准:(1)男方合并有心脏、肝脏、肾脏等器质性疾病者;(2)男女双方有生殖道感染者;(3)生殖器官有肿瘤或者发育不良者;(4)服用严重影响精子质量和生精功能的药物者;(5)重度少精子症(<5×106/mL)者。依据我中心胚胎实验室质控数据考核标准分为低受精组(受精率<30%,n=19)和正常受精组(受精率≥30%,n=308)。

1.2主要仪器及试剂 精液常规分析采用WLJY-9000型计算机辅助精子分析(CASA)系统(北京伟力公司),精子顶体酶活性定量、精子膜表面抗体检测及精子DNA完整性检测试剂盒购自深圳华康生物医学工程公司。HR801型酶标仪购自深圳华科瑞科公司,CX33型普通光学显微镜购自日本Olympus公司,Eppenddorf AG 5424高速离心机购自美国Eppenddorf公司。

1.3精液样本采集及常规分析 纳入对象禁欲2～7天,手淫法取精,样本采集完成后置于37 ℃温箱内液化,参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)对精液量、精子浓度、活力和精子形态进行分析[15]。精液常规室内质控采用自制质控品,每天取2支低浓度和高浓度质控品,室温平衡30 min后充分混匀按日常样品检测,结果均在控。精子形态学染色采用改良巴氏染色,并常规进行室内质控。留取新鲜精液量用作精子顶体酶活性检测,留取至少100 μL精液用于精子DNA完整性检测。

1.4精子顶体酶活性检测 采用改良Kennedy法按照试剂盒说明书检测精子顶体酶活性。试剂配套质控品稀释和保存:质控品冻干粉加入1 mL蒸馏水溶解成质控液,分装后-20 ℃冷冻保存,避免反复冻融,每次取试剂配套的质控品室温平衡后,与临床样本平行测定,质控品检测结果在给定的范围内该批样本结果有效。

1.5抗精子抗体检测及结果判断 采用混合抗球蛋白反应(mixed antiglobulin reaction,MAR)法按照试剂盒说明书检测精子膜表面抗体。结果判读:记录涂片中附着在致敏微球上的活动精子百分率(忽略尾尖结合)。每张涂片至少计数200个活动的精子,记录微球同精子结合的部位(头、中段、尾)。

1.6精子DNA完整性检测及判读 用精子染色质扩散(SCD)法按照试剂盒说明书要求检测精子DNA的完整性。在普通显微镜400×镜头下,观察400个染色的精子,分为大、中、小、无晕环,晕环宽度(b)/精子头直径(a)≥2/3为大晕环;>1/4且≤2/3为中晕环;≤1/4为小晕环;观察不到晕环的精子为无晕环;观察不到晕环且精子核区染色较浅的精子为无晕环和退化。精子核DNA较完整的精子,能观察到深染的精子头部,且有明显的核晕环,呈中晕环或大晕环;而精子核DNA断裂较多的精子,染色后仅能观察到深染的精子头部,看不到晕环或仅有少量核晕存在。精子DNA完整率=(大晕环+中晕环)精子/被观察精子总数×100%。精子DFI=1-精子DNA完整率。精子DFI增高,表明DNA损伤增加,完整性降低。质量控制措施:合适、稳定的反应温度(20～28 ℃)是SCD试验成功的关键;试验操作应严格遵循试验程序,变性时间、裂解时间对SCD试验的成功至关重要。

2 结果

2.1低受精组与正常受精组基本信息及精液参数分析 见表1。低受精组正常形态精子百分率及精子顶体酶活性水平低于正常受精组,而精子DFI水平高于正常受精组(P均<0.01);男女双方年龄、体质指数及其他精液参数在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2精液相关参数与受精率的相关性分析 受精率与精子顶体酶活性、正常形态精子百分率及精子DFI相关,相关系数(r)分别为0.168、0.306、-0.243(P均<0.05),与禁欲天数、精液量、pH、精子浓度、前向运动精子百分率、非前向运动精子百分率、不活动精子百分率及抗精子抗体阳性率无相关性(P>0.05)。

2.3男女双方基本参数及精子相关参数对IVF受精率的影响 采用Logistic回归分析相关基本参数对IVF受精率的影响,IVF受精率受顶体酶活性、正常形态精子百分率及精子DFI的影响(P均<0.05,见表2),并得到预测IVF受精率的Logistic回归方程:IVF受精率=-2.561+0.035×精子顶体酶活性+2.066×正常形态精子百分率-1.51×精子DFI。

表2 进入法Logistic回归分析相关基本参数对IVF受精率的影响

2.4精子顶体酶活性、正常形态精子百分率、精子DFI对IVF受精率的预测价值 用ROC曲线分析精子顶体酶活性、正常形态精子百分率、精子DFI及三者联合对IVF受精率的预测价值,其曲线下面积分别为0.806、0.889、0.827、0.899(图1),均>0.7,提示三者均是IVF受精率较好的预测指标。

注:预估结果指三者联合的预估值

精子顶体酶活性、正常形态精子百分率、精子DFI及三项联合预测IVF受精率的cut-off值、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值,见表3。

表3 精子顶体酶活性、正常形态精子百分率、精子DFI及三项联合预测IVF受精率的性能比较

3 讨论

2019年35岁以下不孕症患者约71.39%选择IVF助孕治疗,其中选择常规IVF者占51.17%,是目前治疗不孕不育的主要途径[16]。但是常规IVF助孕过程中仍有可能出现低受精或者完全不受精的情况,其发生率为3%～5%[17]。对此,构建有效评估模型预测受精率,并采取有效措施来避免受精失败对提升IVF成功率非常有必要。

受精是精子与卵子结合形成合子的过程,任何一方的问题都可能导致受精失败或者异常。前期研究发现[18],男女双方年龄、精子顶体酶活性及卵子成熟度是影响精卵受精的相关因素;女方年龄大于40岁时,精子顶体酶活性对精卵受精率无明显影响。为进一步研究男方精子相关参数与IVF受精率的关系,尽量减少女方因素的干扰,新增了排除标准:女方年龄>40岁、卵子成熟度<50%。本研究中,Pearson相关分析发现正常形态精子百分率、精子顶体酶活性、精子DFI是影响受精率的相关因素。这可能与传统的精液常规检测结果波动与男方身体及精神状态变化大有关。朱春辉[19]的研究也提示传统的精液常规检测无法对精子的受精潜能及男性生育力进行准确评估。

本研究采用Logistic回归分析相关基本参数对IVF受精率的影响,IVF受精率显著受精子顶体酶活性、正常形态精子百分率及精子DFI的影响。众所周知,受精过程是多因素综合作用的结果。因此,本研究用多因素回归分析这3个精子相关参数与受精率的关系,得出方程式:受精率预估值=-2.561+0.035×精子顶体酶活性+2.066×正常形态精子百分率-1.51×精子DFI。进一步用ROC曲线分析三者及三者联合对IVF受精率的预测价值,AUCROC分别为0.806、0.889、0.806、0.899,均>0.7,提示三者均是较好的预测指标。精子作为生殖细胞,结构比较复杂,可分为头部、主段和尾部,任何部位的缺失或形态的改变均可能影响精子功能。相关研究表明,畸形精子头部多伴有顶体或核膜的异常或缺失,细胞核的固缩(凋亡),主段线粒体及微管结构的紊乱,这些异常会导致卵子与精子间相关蛋白及受体表达的失常,从而导致受精失败[20-21]。本研究发现正常形态精子百分率<2.98%,是低受精率的预警指标,其风险值达7.730。

精子头前部的顶体区是包裹在精子细胞核上面的细胞器,是精子特有的结构,含有丰富的水解酶,主要是顶体酶。精子穿过卵子透明带发生顶体反应的过程中,顶体酶由低活性转变为高活性来帮助消化透明带,有利于精子穿透透明带从而完成受精过程。因此,精子顶体酶活性高低直接影响受精过程,多项临床研究表明精子顶体酶活性可以作为评价精子受精功能的重要指标[22-23]。本研究结果显示,精子顶体酶活性是预测IVF受精率的重要因素,顶体酶活性<61.20 μIU/106精子者,低受精的概率高于活性>61.20 μIU/106精子者,二者差异有统计学意义(P<0.05)。

精子DNA完整性反映精子DNA损伤的程度。相关研究表明DNA损伤超过一定阈值时,会影响正常受精、胚胎发育,导致流产率增加[24]。本研究中,ROC曲线分析精子DFI预测IVF受精率的cut-off值为27.50%,敏感性为68.40%,特异性为87.70%,且精子DFI与受精率呈负相关。此外,多项研究也表明精子DFI与受精率和胚胎质量呈负相关[25-26]。

单因素分析提示精子顶体酶活性、正常形态精子百分率及精子DFI对IVF受精率均有影响,多因素联合分析发现,三者联合分析时其AUCROC最大,敏感性、特异性最高,预测效能较单一因素更好。因此可以通过前期检测三项指标来预估患者的受精率以选择合适的助孕方案来提高其成功率。

本中心在女方取卵日对男方精子采用的是密度梯度离心法和上游法优选精子。在本研究中由于优选后精子数量有限,并没有对优选后精子进行常规分析、精子形态学检测、精子顶体酶活性及精子DFI等精子功能检测,存在没有对上述检测指标进行优选前后对比的不足,也没有对优选后精子相关参数与IVF受精率进行相关性分析,这是本研究的不足之处,在今后的研究中将进一步完善。