精浆肉碱测定在男性生育力评估和弱精子症疗效监测中的应用*

开钧,朱来晴,李敏环,孙国海,周雪,汪珣,韩友峰,石亮

(南京大学医学院附属鼓楼医院男科,南京 210008)

肉碱(carnitine),又称肉毒碱,是一种广泛存在于肌肉和乳制品中的类似于胆碱的小分子物质。其中生物活性存在于L-肉碱(L-carnitine,LC),而D-肉碱则无生物活性[1]。作为长链脂肪酸的转运载体,L-肉碱的主要功能是促进脂质在线粒体内发生β氧化,从而产生能量:长链酰基须先经肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1,CPT1)催化与肉碱形成酰基肉碱,再通过肉碱酰基转位酶(carnitine-acylcarnitine translocase,CACT)进入线粒体内膜,最后由CPT2重新生成脂酰辅酶A[2]。当饮食中缺乏肉碱时,将导致代谢异常和内分泌紊乱,因此保持适当的肉碱摄入十分重要。目前L-肉碱作为营养补充剂广泛添加于健身产品中[3]。

精浆是附睾及附睾性腺分泌物的混合物,对于精子的发生、新陈代谢和活力至关重要。其中约90%的肉碱来源于附睾,能够促进精子线粒体发生氧化磷酸化以获取能量[4]。尽管附睾不能自身合成肉碱,但能从血浆中摄取大量游离态肉碱,使其浓度远高于血浆[5]。当精浆肉碱水平偏低时,精子线粒体内脂肪酸β氧化减弱,活力降低,抗氧化能力下降,临床表现为弱精子症(精子活力低下)[6]。因此,精浆肉碱水平不仅能反映附睾功能,也可评估精子活力。

弱精子症指精液量、精子浓度和精子形态等指标正常但精子活力低下的病症[7]。弱精子症患者精浆中的肉碱含量显著低于正常男性,但其检测方法存在成本高、操作复杂、人为误差大等缺点[8]。本研究采用检测试剂盒(固定时间法)检测正常男性和弱精子症患者精浆中肉碱浓度,分析其与精子前向运动性(progressive motility,PR)的关系,旨在评估精浆肉碱能否作为反映精子活力和生育能力的新型指标。前期研究发现,外源性补充肉碱可明显提高弱精子症患者的精子活力,为临床治疗提供新思路。如Ma等[9]发现给予L-肉碱3个月后患者精浆肉碱水平显著上升;Micic等[10]联合给予L-肉碱和L-乙酰肉碱6个月后患者精子活力显著改善;李伟等[11]发现体外向精液中加入L-肉碱后正常男性精子活力下降延缓,而弱精子症患者精子活力则上升。基于此,本研究拟进一步观察弱精子症患者在服用肉碱补充剂后,精浆肉碱水平和精子活力的变化情况。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集就诊于南京大学医学院附属鼓楼医院男科511例就诊者的精液样本,其中:(1)正常可育男性103例(精子浓度≥15×106/mL,精液量≥1.5 mL,PR≥32%,正常形态精子百分率≥4%);(2)弱精子症患者408例(精子浓度≥15×106/mL,精液量≥1.5 mL,PR<32%,正常形态精子百分率≥4%)。

1.2主要仪器与试剂 BS-350E全自动生化分析仪(深圳迈瑞公司);精浆肉碱检测试剂盒、精浆复合质控品(南京欣迪生物药业公司);左卡尼汀口服液(东北制药公司)。

1.3方法

1.3.1精液样本收集 所有精液样本均通过手淫法(禁欲2～7天)获得。将新鲜精液置于37 ℃水浴锅内温育至完全液化,再进行后续分析。

1.3.2精液常规分析 参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第6版),采用SSA-Ⅱ计算机辅助精子分析(CASA)系统(北京穗加公司)进行精液分析。收集4～5个视野,计数≥200条精子,由软件自动识别并追踪记录精子运动轨迹,从而得出精子浓度和活动精子百分率。室间质控采用江苏省妇幼健康研究会生殖检验质控中心提供的质控品(每半年1次);室内质控采用本实验室自制非定值质控品(每日1次)。

1.3.3精浆肉碱检测 精浆L-肉碱检测原理为肉碱在肉碱乙酰转移酶催化下与乙酰辅酶A反应生成辅酶A,辅酶A进而与5,5′-二硫代-双(2-硝基)苯甲酸发生颜色反应生成具有最大吸收峰(400～420 nm)的5-巯基-2-硝基苯甲酸阴离子。通过测定不同浓度样本的吸光度变化,即可计算出样本中肉碱含量。取≥1 mL精液,3 000×g离心5 min后收集上层精浆。严格按说明书配制工作液,利用试剂盒内校准品绘制标准曲线。每次检测采用质控品作为质控。

1.3.4治疗方法 弱精子症患者服用左卡尼汀口服液[1 g肉碱(10 mL)/次,3次/日],连续30日为1个疗程。

2 结果

2.1可育男性和弱精子症患者精浆肉碱浓度的比较 见表1。可育男性组和弱精子症患者组的精液量差异无统计学意义(P>0.05),但弱精子症患者组精子浓度、PR和精浆肉碱浓度均低于可育男性组(P均<0.05)。

表1 可育男性与弱精子症患者精液常规参数和精浆肉碱浓度比较

表2 精浆肉碱与精子PR的一致性比较

2.3左卡尼汀治疗对精浆肉碱及PR的影响 见表3。77例弱精子症患者给予左卡尼汀口服溶液(1 g/次,3次/日,30日/疗程)治疗后,精浆肉碱浓度和PR均显著升高(P均<0.01)。

表3 左卡尼汀治疗前后PR和精浆肉碱浓度比较

3 讨论

据WHO调查显示,约有15%育龄夫妇存在不育问题,其中男性因素约占一半[12]。精子活力能够直接反映精子质量,提示男性生育力强弱。弱精子症指精子浓度正常,但PR低于32%。精子前向运动需要靠尾部的线粒体氧化磷酸化产生动力[13]。L-肉碱是线粒体膜上介导脂肪酸β氧化的关键载体,直接调控线粒体产能。当精浆肉碱水平偏低时,精子线粒体产能减少,精子活力降低,导致男性生育力下降[14]。

本研究采用精浆肉碱检测试剂盒(固定时间法)检测精浆肉碱发现,弱精子症组精浆肉碱含量显著低于正常可育男性,且与PR呈高度一致性(Kappa=0.81),提示精浆肉碱水平可作为男性生育力评估的新型指标。进一步观察到,服用L-肉碱后,弱精子症患者精浆肉碱浓度和PR均显著升高,说明外源性补充肉碱有助于提高生育能力。

除了增强线粒体活力,肉碱的抗氧化特性也有利于改善精子质量:(1)清除活性氧簇积累,缓解细胞DNA损伤[15];(2)阻断线粒体凋亡通路,逆转细胞命运[16];(3)降低精液中氧化应激水平[17-18];(4)抑制氧化应激和自噬反应等[19-20]。此外,商学军等[21]发现L-肉碱还可改善精子DNA完整性,降低DNA碎片化指数(DNA fragmentation index,DFI)。然而,本研究未对精子氧化应激水平进行检测,这将在后续研究中开展。

虽然肉碱在临床上广泛应用于男性不育症治疗,但部分患者疗效欠佳,反映其发病机制的复杂性。本研究建立了快速、准确监测精浆肉碱的方法,为临床上肉碱治疗的个体化指导和疗效评估提供了有力支持。