绵羊去甲基化酶FTO基因的生物信息学分析

孟金柱 杨显刚 赵园园

(铜仁学院贵州省梵净山地区生物多样性保护与利用重点实验室，贵州 铜仁 554300)

脂肪肥胖相关基因(Fatmassandobesity-associatedprotein，FTO)最初作为人类肥胖相关基因被发现，编码的FTO蛋白属于双加氧酶家族，其酶活性依赖于二价铁离子和2-氧葡萄糖酸酯[1]。在酶学上，FTO是真核细胞中的RNAN6-甲基腺苷(m6A)去甲基化酶[2]。m6A可以调节一些细胞过程，包括可变剪接、mRNA稳定性、加工、翻译、运输、降解和基因调控等[3-6]。m6A失衡与各种人类疾病有关，如肥胖、糖尿病、心力衰竭、脑部疾病和各种癌症[7-9]。此外，FTO还影响精原细胞增殖、肌纤维分化、细菌抗性等[10-12]。

近年来，人们陆续完成了牦牛、猪、驴、山羊等物种的FTO基因的克隆，并发现FTO基因可能参与畜禽的脂肪沉积、卵母细胞成熟、热应激、肌肉发生等生物学过程[13-22]。为探究绵羊FTO基因的结构及功能，本研究利用RNA-seq获取的FTO基因序列，采用生物信息学方法，分析FTO基因序列、蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、二、三级结构、亚细胞定位及与其他蛋白相互作用网络等，为进一步探讨FTO的功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 高通量测序及序列获取

本课题组前期进行了不同毛色绵羊皮肤的转录组测序并已发表相关论文[23]，本研究所用绵羊FTO基因序列由高通量测序结果中获取。

1.2 绵羊FTO基因的生物信息学分析

序列通过生物信息学软件进行分析，具体软件或工具如表1所示。

表1 绵羊FTO核苷酸和蛋白质序列分析软件

2 结果

2.1 绵羊FTO基因进化树

高通量测序共检测到3个FTO基因的转录本，分别包含3个、9个、11个外显子，最长的转录本CDS区为1518bp，与NCBI登录的绵羊FTO基因(NM_ 001104931.1)序列相似性为100%。利用MEGA11.0与GenBank数据库中8个物种的核苷酸序列进行比对并构建进化树，发现绵羊FTO基因与山羊的亲缘关系最近，其次是羚羊、弯角剑羚，随后与亚洲水牛、瘤牛、美洲草原野牛、牦牛聚类到一起，再与加拿大马鹿聚类，与河马的亲缘关系最远，同时绵羊FTO基因在各物种间具有较高的保守性。

图1 不同物种FTO基因核苷酸序列构建的系统进化树

2.2 绵羊FTO蛋白理化性质预测

NCBI Open Reading Frame Finder预测绵羊FTO基因CDS区的开放阅读框，结果显示，FTO基因共编码505个氨基酸，见图2，其中亮氨酸(Leu)含量最多(11.1%)，谷氨酸(Glu)含量次之(10.3%)，组氨酸(His)含量最少(2.6%)；肽链N端为蛋氨酸(Met)；带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)残基数量共60个，带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)残基数量共79个，见表2。使用在线工具Expasy-ProtParam预测绵羊FTO蛋白理化性质，FTO蛋白分子式C2609H4053N709O771S27，蛋白质分子的质量为58553.79，由8169个原子构成，理论等电点(isoelectric point，pI)为5.28，<7，表明蛋白为酸性物质；半衰期为30h。不稳定指数为51.24，>40，说明该蛋白结构不稳定。亲水性平均值(grand average of hydropathicity，GRAVY)为-0.523<0，脂溶指数为80.71。使用Expasy-ProtScale得到结果推测FTO蛋白在12位点处存在最小亲水指数-3.222，在438位点存在最大亲水指数2.000，疏水性平均值-0.523，见图3，表明绵羊FTO蛋白属于亲水性蛋白。

图3 绵羊FTO蛋白亲/疏水性预测

表2 绵羊FTO蛋白的氨基酸组成及数量

2.3 绵羊FTO蛋白信号肽及跨膜结构域

使用Signaip-4.1进行绵羊FTO蛋白质的信号肽预测，发现该蛋白无信号肽序列，表明FTO蛋白质不具有信号肽结构。使用TMHMMServerv.2.0分析跨膜结构域，结果显示，FTO蛋白不存在跨膜序列，见图4，推测FTO蛋白不是膜蛋白或分泌蛋白。

图4 绵羊FTO蛋白信号肽及跨膜结构域预测

2.4 绵羊FTO基因亚细胞定位

使用WoLFPSORT预测绵羊FTO的亚细胞定位，结果显示FTO主要分布在细胞外基质中，其次是质膜、细胞核和溶酶体，见表3。

表3 绵羊FTO蛋白亚细胞定位

2.5 绵羊FTO蛋白二、三级结构

使用SOPMA和SWISSMODEL分别进行绵羊FTO蛋白二、三级结构预测，结果表明，该多肽链中含有43.17%α螺旋、38.61%无规则卷曲、11.49%延伸链和6.73%β折叠，见图5。三级结构也显示绵羊FTO蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。

注：h为α-螺旋；t为β-转角；c为无规则卷曲；e为延伸链。

2.6 绵羊FTO互作蛋白网络图

通过在线工具STRING在置信度为90%的条件下构建绵羊FTO互作蛋白网络图，结果表明，FTO与FOXO1、CREB1、ALKBH8、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF3、YTHDF2、METTL14、WTAP、METTL3等10个蛋白互相紧密联系，可能存在互作，见图6。

图6 绵羊FTO蛋白互作网络图

3 讨论与结论

FTO基因除可直接调控脂肪合成和分解相关基因进而促使脂肪沉积量外，还能通过调控RNA m6A水平进而参与各种生物学过程的调控[19-22]。本研究显示，绵羊的FTO基因编码区为1518bp，编码505个氨基酸，其中蛋白亮氨酸(Leu)含量最多(11.1%)，为酸性亲水性蛋白，带负电，结构不稳定，与滩羊[13]、牦牛[14]、广灵驴[15]、陆川猪[16]、山羊[17]一致。绵羊的FTO蛋白不存在信号肽、跨膜结构，与山羊[17]、牦牛[14]、广灵驴[15]一致，而滩羊[13]FTO蛋白在第33～34氨基酸残基处具有信号肽，表明绵羊在导向、分泌和参与蛋白质折叠等功能与滩羊具有差异，但在信号传递和物质转运能力上相同。绵羊的FTO蛋白主要分布于细胞外基质中，而广灵驴FTO蛋白也主要分布于膜外[15]。将绵羊FTO蛋白二级结构中α螺旋含量最多，其次是无规则卷曲、延伸连和β折叠，滩羊、牦牛[27]、广灵驴[28]也呈现出类似的结构，但山羊[17]FTO蛋白以无规则卷曲和α-螺旋最多，其次是β折叠，无延长链。虽然山羊与其他动物的二级结构稍有差异，但都以α-螺旋和无规则卷曲为主，占到80%以上，这也表明FTO蛋白结构不稳定。

蛋白互作网络图显示，绵羊FTO蛋白共与10种蛋白(FOXO1、CREB1、ALKBH8、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、METTL14、WTAP、METTL3)具有互作关系，已有研究表明，FTO可能与FOXO1相互作用参与非酒精性脂肪肝的发病过程[23]。FOXO1作为叉头转录家族O亚族成员，参与癌症、自噬、氧化应激及物质代谢等多种生物学过程[24]。这暗示FTO可能通过与FOXO1相互作用参与广泛的生物学过程。CREB参与了神经干细胞的增殖、细胞周期调控、神经元诱导分化、学习记忆等正常生理活动[25]，推测FTO可能通过与CREB互作调控多个生理活动。ALKBH5和ALKBH8属于ALKB核酸脱甲基酶家族成员，对细胞核mRNA进行去甲基化修饰[26]。YTHDF1/2/3作为mRNAm6A修饰的阅读蛋白参与RNA甲基化调控，而METTL3、WTAP和METTL14组成复合物催化m6A甲基化产生[27]。因此，FTO可能与其他RNA甲基化相关酶共同调节RNA的m6A水平。

总之，绵羊FTO基因与其他哺乳动物的相似性高，具有高度保守性，绵羊FTO蛋白由505个氨基酸组成，酸性，结构不稳定，属亲水性非分泌蛋白，无信号肽和跨膜结构，主要与RNA甲基化相关酶互作，为深入研究绵羊FTO基因功能提供了理论基础。