宁夏番茄地田间杂草携带主要病毒检测及分析

戴荣 李建设

(宁夏大学葡萄酒与园艺学院，宁夏 银川 750021)

引言

番茄是宁夏设施冷凉露地主要栽培蔬菜之一[1]，其罹患的病毒病呈现出爆发性强，传播快且危害范围广的现象，是造成番茄减产的重要原因[2]。目前，番茄可感染病毒病的种类较多，同时番茄出现复合侵染的情况较为普遍[3-5]。而田间杂草对番茄生长会造成严重威胁[6]，与番茄竞争生长空间，同时也为番茄病毒病的传播提供了媒介[6]。目前，已对宁夏番茄植株上携带的病毒病种类做出鉴定[7-10]，但番茄田间杂草携带病毒种类还未有报道。本研究主要针对宁夏3个县(市)7个乡镇56块疑似携带病毒的番茄地田间杂草进行采样，采取PCR、RT-PCR技术，明确田间杂草携带病毒种类，以期为今后番茄病毒病的防控提供更加科学的指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2023年8月，对宁夏3个县(市)7个乡镇共计56块番茄田进行采样调查。对疑似发病番茄周边(地膜下杂草不取)的杂草进行拍照、采样。株型小的杂草采集全株，株型大的杂草使用75%乙醇消毒后的剪刀剪取带叶片的茎秆(藤蔓)1～2条，装入装样袋，做好标记。将采集样品立即置于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱保存备用。每剪取1个样品后立即用75%乙醇擦拭剪刀消毒处理。

1.2 植物总DNA/RNA的提取及cDNA的合成

参照试剂盒提供的方法，分别使用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(货号：DP441)与天根多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP360)提取田间杂草总RNA/DNA。以提取的总RNA为模板进行反转录。采用Vazyme生物公司的HiscriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit(货号：R312-01)进行反转录，反应的体系及步骤参照产品说明书。

1.3 番茄病毒引物信息

宁夏地区番茄病毒病主要受到番茄花叶病毒(tomato mosaic virus，ToMV)、番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)、番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus)、南方番茄病毒(STV)、番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus，ToCV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)7种病毒的侵染，并新发现番茄褐色皱纹病毒病(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)。同时检测另外常见的2种侵染番茄的病毒——烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus，TZSV)。引物相关信息见表1。

表1 用于RT-PCR扩增番茄病毒的特异性引物

1.4 RT-RCR/RCR及电泳检测

PCR/RT-RCR检测：利用病毒特异性引物，见表1，按下述体系与条件扩增。体系：2×TaqMaster Mix(Dye Plus)(货号：P112-01)10μL，上下引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 7μL。条件：94℃→4min；94℃→30s，53℃→30s，72℃→45s，34个循环，72℃延伸10min。扩增完成，分别取4μL扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳检测，并用全自动凝胶成像系统记录结果。

2 结果与分析

2.1 杂草感染病毒的表现特征

通过走访拍照采样发现，与正常生长的杂草相比，感染病毒的苦苣菜上部新叶出现浅黑褐色斑点，见图1a；下部老叶斑点颜色加深，斑点扩大，轻微萎缩，叶片蜷曲，可从叶片扩展至整棵植株，见图1b；叶片背部叶脉由绿转紫，茎秆支撑力变弱，植株倒伏，部分叶片发生脱落，见图1c。马齿苋叶片出现黄色斑点，见图1d；反枝苋新叶呈现黄色斑点，老叶边缘黄化、褪绿，从边缘辐射至叶脉，出现枯斑，见图1e；打碗花叶片出现黄绿相间的花叶，见图1f，茎秆发黄变脆，叶片向下卷曲，蔓延至整棵植株；凹头苋叶片背部与长鬃蓼叶片正面，见图1g、图1h，均出现浅褐色斑点，集中密集；乳苣叶片出现古铜色斑块，见图1i，部分斑块枯萎，叶片背部也清晰可见。

注：a～c为苦苣菜(菊科)；d为马齿苋(马齿苋科)；e为反枝苋(苋科)；f为打碗花(旋花科)；g为凹头苋(苋科)；h为长鬃蓼(蓼科)；i为乳苣(菊科)。图1 几种杂草侵染病毒田间症状

2.2 宁夏番茄田间不同种类杂草所携带病毒检测结果

通过对采集的18科53种576份杂草样品提取总RNA/DNA，利用特异性引物进行RT-PCR/PCR扩增，如表2所示，结果表明，共检测出6种病毒，分别为ToMV、TYLCV、TSWV、ToMMV、STV、ToCV。其中，295份样品检出病毒，有281个样品未检测到病毒，病毒检出率高达51.22%。

表2 宁夏番茄田间杂草及其携带病毒种类

不同病毒感染的杂草种类与感染率有一定差异。STV可侵染的杂草种类和数量最多，除黄花蒿外18科52种193株杂草被感染，杂草种类间感染率略有差异，节节草感染率最高为64.71%，马唐的感染率最低为9.09%；其次是ToCV，可侵染17科45种杂草，采集的菊科杂草2/3可被侵染；ToMV可感染12科23种杂草，菊科可侵染杂草种类最多，包括欧洲千里光、花叶滇苦菜等5种杂草；受到TYLCV侵染的杂草高达31种，采集的禾本科杂草均可感染此病毒，以冰草最甚，侵染率高达100%；TSWV可侵染的杂草种类最少，涉及6科11种杂草，十字花科的3种杂草皆可感染此病毒，1/2独行菜样品检测出此病毒；ToMMV可侵染的杂草种类最少，涉及5科8种杂草，包括马唐、早熟禾、苦苣菜、黄花蒿、藜、地肤、打碗花与野西瓜苗。

从被感染杂草种类的角度来分析，STV感染杂草的情况依次为其他科、苋科、藜科、菊科、蓼科、禾本科；ToCV感染率排序为苋科>其他科>藜科>菊科、蓼科>禾本科；ToMV感染杂草的种类最低为藜科，禾本科、菊科、苋科感染率相差不大，蓼科未检测到被侵染杂草；TYLCV感染率排序为苋科>禾本科>菊科>藜科>蓼科>其他科；TSWV感染率的高低顺序为其他科>苋科>菊科，其中禾本科、蓼科与藜科未检测到杂草感染；ToMMV感染率排序为其他科>禾本科>藜科>菊科，蓼科与苋科未检测到感染样本。

对杂草感染番茄病毒种类整理并进行数据分析，STV的检出比例最高为33.51%，是危害宁夏范围最广的病毒；其次是ToCV，检出率为27.95%；ToMV、TYLCV的检出率分别为13.37%、14.41%；TSWV、ToMMV总检出率较低，分别为5.73%、4.17%。

2.3 宁夏地区杂草携带番茄病毒的复合侵染分析

使用ToMV、TYLCV、TSWV、ToMMV、STV与ToCV的特异性引物，见表1，对所采集的576份样品进行PCR/RT-PCR检测，结果显示，分别扩增出480bp、648bp、425bp、1193bp、681bp、450bp。而TMV、CMV、TZSV、ToBRFV与阴性对照均未扩增出目的条带。对采自立岗镇的打碗花进行实验，扩增出480bp、425bp、681bp、450bp 4条特异性DNA条带，见图2，分别为ToMV、TSWV、STV、ToCV 4种病毒。说明所采集的番茄地田间杂草发生了复合侵染现象。

1.番茄花叶病毒；2.番茄黄化曲叶病毒病；3.番茄斑萎病毒；4.烟草花叶病毒；5.番茄斑驳花叶病毒；6.南方番茄病毒；7.黄瓜花叶病毒；8.番茄褪绿病毒；9.番茄环纹斑点病毒；10.褐色皱纹果病毒；11.阴性对照；M.分子质量标准DL2000 DNA Marker图2 打碗花PCR/RT-PCR扩增电泳凝胶图像

通过对杂草感染番茄病毒复合侵染的现象进行分析发现，见表3，在292份阳性样品中，有37份样品为单一病毒感染，复合侵染率高达87.33%。2种病毒复合侵染情况最严重，占复合侵染总比的41.57%，其中STV加ToCV为优势毒株，在宁夏地区侵染面积最广，感染植株种类最多；3种病毒复合侵染类型较多，侵染率为38.04%；4种病毒复合侵染率略低，占复合侵染总比的19.61%；5种病毒侵染率最低，为0.78%，病毒感染种类复杂，分别为ToMV加TSWV加ToMMV加STV加ToCV，ToMV加TYLCV加ToMMV加STV加ToCV。暂未检测出6种病毒的复合侵染。

表3 宁夏地区杂草主要病毒病侵染率

3 讨论

本研究采用分子技术检测的方法，对采自宁夏3个县(市)7个乡镇56块番茄田18科53种576份杂草样本进行病毒检测，结果共检测出ToMV、TYLCV、TSWV、ToMMV、STV与ToCV 6种病毒。刘晨等研究认为，TYLCV可以感染多种杂草[15]，本试验暂未得到全部验证，可能与样本数量、采样地环境、药物控制及此地频发病毒类型等原因相关。TSWV可侵染的杂草以菊科侵染的数量占比最大，与李婷婷等研究结果吻合[16]，同时杂草也是TSWV越冬毒源[17]。STV可侵染的杂草种类和数量最多，遍布所采样本的18科52种193株杂草；ToCV为宁夏番茄病毒病的主流病毒[18]，发现可侵染17科46种杂草；表明STV、ToCV这2种病毒在杂草上的寄主广泛，以禾本科和菊科可侵染杂草种类最多；且卢丁伊慧等通过对ToCV的模型研究得出，上一茬番茄收获后，杂草作为中间寄主，利用烟粉虱的活动侵染下一茬番茄，形成周期性循环[19]。ToMMV自宁夏地区番茄上检出后，首次在禾本科、菊科、藜科等5科8种杂草上被鉴定，检出率为4.17%，可能通过混有病残体的土壤、种子与携带病毒的植物摩擦[20]传播此病毒。ToMV可侵染禾本科等11科22种杂草，与张海峰研究相符合[21]，或通过与感病番茄叶片摩擦、携带病毒的土壤和残存的根茎与种子带毒传播[22]。ToMMV与ToMV的寄主范围有一定差异[23]。高温干旱、粉虱的爆发与病毒病的传播密切相关[24]。从杂草类型的角度分析，禾本科与菊科感染频率最高，可能与这2种杂草种类多且为田间优势杂草有关。所采集的样品来自番茄采收末期，正值番茄病毒爆发期。高温干旱，粉虱、蓟马等虫害，田间管理与病株间相互摩擦等综合因素使得病毒侵染率居高不下。

蔬菜作物上检出病毒复合侵染情况不足为奇，不同类型病毒发生复合侵染，导致植物内病毒间协同或拮抗，更多表现为协同[25]。杂草最多可被5种病毒同时侵染，STV与多种病毒复合侵染，在山东[28]、新疆[29]、北京[30]等地均有报道。本研究通过对番茄病毒在杂草上复合侵染的现象进行分析发现，2种及2种以上病毒复合侵染现象频发。复合侵染的杂草样本占总样本数量的44.27%，主要以ToMV与TSWV、ToMMV、STV、ToCV、TYLCV病毒发生复合侵染，其中2种病毒复合侵染情况最严重，占复合侵染总比的41.57%，以STV加ToCV复合侵染为宁夏地区优势病毒。检测出ToCV与TSWV侵染，这2种病毒间发生相互协作[26]。刘微研究表明，ToCV与烟粉虱、植物三者存在互作关系，与健康番茄相比，带ToCV的番茄释放出的物质吸引烟粉虱取食，加速病毒的传播[27]。猜测携带ToCV的杂草也可释放出吸引烟粉虱来取食的物质，从而加速病毒传播。而TSWV加ToCV两者的协同作用或导致对2种病毒敏感的番茄加速死亡，携带Sw-5抗病基因的番茄对TSWV表现出抗性[26]；在杂草上是否表现抗性或加速死亡，还需进一步探究。TYLCV加TSWV加STV加ToCV 4种病毒的复合侵染，或因昆虫获毒、病毒协作、土壤带毒所致[31]。杂草出现病毒复合侵染与病毒的传播方式、周围环境、土传病害、栽培作物等息息相关[10]。

试验样品采自番茄收获末期，未体现不同生长阶段番茄与杂草携带病毒的差异性及相关性；番茄生长后期携带病毒种类繁多，可能导致杂草带病毒率更高。杂草是否感染宁夏地区番茄病毒病的其他毒源，还需进一步扩大样本容量去证实。

4 结论

宁夏地区番茄地田间杂草感染番茄病毒情况较为严重，2种病毒复合侵染情况最为普遍，暂未发现杂草不感染番茄病毒。杂草作为昆虫栖身地与饮食场所，也是病毒传播的重要寄主[16，32-35]，为番茄病毒病的传播提供了可能，控制杂草在控制番茄病毒传播的同时有效减轻对作物伤害。结合前人众多研究成果和本研究结果分析认为，在农业操作中，种植前彻底铲除田间杂草成为必要的工作[36]，还要控制田间昆虫数量，减少传播来源，切断传播途径[37]，实行轮作，以避免因杂草、种子或土壤带毒传染下一茬作物，引发番茄病毒病，从而造成减产和品质下降。