NLR 对局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前尼妥珠单抗联合新辅助化疗疗效预测价值研究

田亮亮， 南欣荣，2

1.山西医科大学口腔医学院·口腔医院, 山西 太原（030001）； 2.山西医科大学第一医院口腔颌面外科， 山西 太原（030001）

口腔癌是常见的恶性肿瘤，主要为原发于舌、颊、牙龈、硬腭、口底等部位的鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）。由于早期口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）症状并不明显，不少患者就诊时已达临床Ⅲ/Ⅳ期，导致较差的临床转归。尽管众多学者致力于提高晚期OSCC患者的生存率，但是OSCC 患者5 年生存率仍在50% ～ 60%。研究发现，90%的头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）中存在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的过表达［1］，EGFR 被激活后，可调节相关下游信号通路，通过激活转录因子和上调重要癌基因来刺激肿瘤细胞增殖，促进肿瘤进展［2］。尼妥珠单抗是靶向EGFR 的单克隆抗体，Patil等［3］研究指出，尼妥珠单抗联合化疗可以在不增加毒副反应的基础上表现出较好的肿瘤反应率。临床实践表明，治疗效果对预后影响较大，新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）作为OSCC 患者的重要治疗方案，可提高手术切除率，对改善预后有重要意义［4］。

炎症在肿瘤微环境中具有重要作用，可促进肿瘤的发展、侵袭、转移，并且与预后不良相关［5］。Ram 等［6］研究表明，血液学炎症指标，如中性粒细胞/淋 巴细胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）对OSCC 的预后判断具有重要意义。Yang等［7］Meta 分析表明，高NLR 与OSCC 的不良临床病理特征、较差的生存期相关。尽管有众多学者研究外周血炎症指标与OSCC 的关系，但其与OSCC术前尼妥珠单抗联合新辅助化疗疗效之间的关系目前尚无明确定论。本研究探讨外周血NLR 对局晚期OSCC 患者采用尼妥珠单抗联合新辅助化疗疗效的影响，为临床提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

本研究通过山西医科大学第一医院伦理委员会审批（［2020］伦审字（K065）号），获得患者知情同意。收集 2020 年9 月至2023 年6 月山西医科大学第一医院收治的局晚期OSCC 患者59 例。纳入标准：①病理诊断均为鳞状细胞癌，临床分期为Ⅲ、Ⅳ期的初诊病例；②所有病例均接受尼妥珠单抗联合术前新辅助化疗；③化疗后再次完善影像学检查，评估疗效及行根治性手术；④患者化疗前1 周内血常规完整；⑤能配合完成医院治疗及随访。排除标准：①严重心肺功能障碍；②严重肝肾功能或骨髓造血功能异常; ③合并有其他恶性肿瘤。收集完整的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况和是否神经侵犯等。

1.2 研究方法

1.2.1 术前尼妥珠单抗联合新辅助化疗方案

59 例患者均接受尼妥珠单抗+TP（多西他赛+顺铂）术前新辅助化疗，化疗结束2～3 周后入院行肿瘤根治性手术。诱导化疗方案为：尼妥珠单抗注射液（400 mg，d1）+多西他赛注射液（75 mg/m2，d2）+顺铂注射液（30 mg/d，d2-d4）。

1.2.2 确定NLR 阈值及分组 收集患者化疗前及化疗后外周血中性粒细胞、淋巴细胞数值，NLR=中性粒细胞计数/淋巴细胞计数。应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC），得到化疗前NLR 阈值，将患者分为高NLR组、低NLR 组。

1.2.3 疗效判断 对所有患者在用药前及用药后2 ～ 3 周均进行核磁共振影像学检查，检查结果由2名经验丰富的影像科医师测量肿瘤原发灶的最大径，意见不一致时由双方商讨决定。参照临床实体瘤评价标准（response evaluation criteria in solid tumours version 1.1， Resist v.1.1）评定疗效，分为完全缓解（complete response，CR）、部分缓解（partial response，PR）、疾病稳定（stable disease，SD）和疾病进 展（progressive disease，PD），有 效 率（response rate，RR）=（CR+PR）/总例数。尼妥珠单抗联合新辅助化疗后根据实体瘤疗效评价标准评估化疗疗效。

1.2.4 免疫组织化学检测组织标本中EGFR 的表达变化

使用免疫组化方法测定新辅助化疗前后OSCC组织中EGFR 的表达，使用平均光密度值反映阳性表达率。

采集两组病灶组织标本，将其常规进行甲醛固定及石蜡包埋等处理。实验开始前将蜡块放置-20 ℃冰箱中冰冻30 min，切成4 μm 的薄片，烤片机烤干后进行免疫组织化学染色。将石蜡切片、脱蜡、水化，消除内源性过氧化物酶，再依次进行冲洗、抗原修复和暴露，室温孵育10 min，在每张切片上分别滴加工作浓度为1∶200 的一抗工作液100 μL（Ag24847，来源于鼠，武汉三鹰生物技术有限公司)，4 ℃孵育过夜，次日用PBS水洗3次，每次5 min，滴加工作浓度为1∶500 的二抗100 μL（酶标羊抗鼠IgG 聚合物，PK10018，武汉三鹰生物技术有限公司），室温孵育后，PBS 清洗3 次，每次5 min。采用DAB 显色，苏木素进行复染，冲洗。将切片脱水透明后自然风干，取适量封片胶封片。使用人乳腺癌组织阳性切片为阳性对照，PBS 缓冲液代替一抗工作液为阴性对照［8］。采用3D Histech 扫描分析系统对切片进行扫描，提取图像。阳性表达结果采用平均光密度值反映，每个标本随机选取3 个视野（×400），采用图像处理软件Image J 进行半定量分析，测定平均光密度值，取平均数为最终的平均光密度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS25.0 软件对数据进行统计分析，分类资料采用例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。平均光密度值用均数±标准差表示，组间比较如符合正态分布采用t 检验，若不符合正态分布采用秩和检验。应用受试者工作特征曲线计算NLR最佳阈值。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

共收集59 例患者，男性35 例，女性24 例，年龄42～78 岁，中位年龄63 岁。59 例患者中舌癌12 例，颊癌15 例，牙龈癌21 例，口底癌10 例，硬腭癌1 例；Ⅲ期24 例，Ⅳ期35 例。

2.1 ROC 分组及分析

以治疗有效率为状态变量，NLR 为检验变量，绘制ROC 曲线（图1）。ROC 曲线下面积=0.753，95%CI= （0.625-0.881），P＜0.01。根据约登指数得到最佳截取值为2.377，对应敏感度为0.857，特异度为0.645。根据截断值将纳入病例分为＜2.377组24 例，＞2.377 组35 例。

Figure 1 ROC curve of the NLR for predicting the efficacy of preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP for locally advanced oral squamous cell cancer图1 NLR 对局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗疗效预测的ROC 曲线

2.2 新辅助治疗前NLR 与新辅助治疗疗效之间的关系

低NLR组经术前尼妥珠单抗联合新辅助化疗后疗效评价，CR 3 例，PR 17 例，SD 4 例，PD 0 例，RR 83.3%；高NLR 组尼妥珠单抗联合新辅助化疗后疗效评价：CR 1 例，PR 10 例，SD 24 例，PD 0 例，RR 31.4%。分析结果显示，低NLR 组和高NLR 组近期新辅助治疗疗效有统计学差异，χ2= 15.592，P＜0.001（表1），典型MRI 影像学变化见图2。

表1 低NLR 组与高NLR 组局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗疗效对比Table 1 Comparison of preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP between patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group

Figure 2 Representative cases of efficacy evaluation before and after neoadjuvant chemotherapy in patients with advanced oral squamous cell cancer who received preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP图2 局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗前后疗效评估代表性病例

2.3 新辅助治疗后NLR 变化

新辅助治疗后NLR 总体呈下降趋势，NLR 范围波动在0.5 ～ 10.2，平均值为2.95 ± 2.47，与化疗前NLR 相比，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

表2 低NLR 组与高NLR 组局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗后NLR 变化情况Table 2 Changes in the NLR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

表2 低NLR 组与高NLR 组局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗后NLR 变化情况Table 2 Changes in the NLR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

In the low NLR group, the difference between the NLR before and after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy was statistically significant.In the high NLR group.The change in the NLR before and after neoadjuvant therapy was statistically significant.NLR: neutrophil to lymphocyte ratio; TP: docetaxel and cisplatin

Groups Lower NLR group Higher NLR group n t P After neoadjuvant therapy 1.423 ± 0.458 3.342 ± 0.350 Before neoadjuvant therapy 1.857 ± 0.346 4.468 ± 0.457 0.012 0.041 24 35 2.987 1.986

2.4 新辅助治疗前NLR 与临床病理特征之间的关系

化疗前高、低NLR 组间年龄、性别、肿瘤部位、临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移、是否神经侵犯均无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 低NLR 组与高NLR 组局晚期口腔鳞状细胞癌患者临床病理特征之间的关系Table 3 Relationship of clinic pathological features of patients with locally advanced oral squamous cell carcinoma between low NLR and high NLR group

2.5 EGFR 表达情况

使用免疫组化方法检测尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗前后OSCC 组织中EGFR 的表达情况，EGFR 的表达主要位于细胞膜和细胞质，表现为棕黄色颗粒。低NLR 组新辅助治疗前EGFR 蛋白表达的平均光密度值为0.113 ± 0.026，新辅助治疗后降为0.044 ± 0.015，差异有统计学意义（P＜0.05）；高NLR 组新辅助治疗前EGFR 蛋白表达的平均光密度值为0.124 ± 0.018，新辅助治疗后降为0.084 ±0.013，差异有统计学意义（P＜0.05）。低NLR 组和高NLR 组新辅助治疗后EGFR 表达皆出现下降，低NLR 组较高NLR 组下降幅度更大，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。高NLR 组和低NLR 组新辅助治疗前后EGFR 表达情况见图3。

表4 低NLR 组与高NLR 组局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗后EGFR 变化情况Table 4 Changes in the EGFR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

表4 低NLR 组与高NLR 组局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗后EGFR 变化情况Table 4 Changes in the EGFR in patients with advanced oral squamous cell cancer in the low NLR group and the high NLR group after nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP before surgery ± s

The change in optical density was obtained by subtracting the average optical density before neoadjuvant therapy from the average optical density after neoadjuvant therapy.The change in the mean optical density of EGFR expression before and after neoadjuvant therapy was significantly different between the low NLR group and the high NLR group,and the decrease was greater in the low NLR group.These results indicated that EGFR expression decreased more in the low NLR group after neoadjuvant therapy, and the neoadjuvant therapy effect was better.EGFR: epidermal growth factor receptor; NLR: neutrophil to lymphocyte ratio

Groups n Change t P Lower NLR group Higher NLR group 24 35 2.120 2.038 0.043 0.031 t P Before neoadjuvant therapy 0.113 ± 0.026 0.124 ± 0.018 1.694 0.064 After neoadjuvant therapy 0.044 ± 0.015 0.084 ± 0.013 2.122 0.036 0.068 ± 0.008 0.040 ± 0.011 3.264 0.036

Figure 3 Comparison of EGFR expression in the oral cancer tissues of patients with advanced oral squamous cell carcinoma in the low NLR group and high NLR group before and after preoperative nimotuzumab combined with neoadjuvant chemotherapy with TP图3 局晚期口腔鳞状细胞癌患者术前接受尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗前后低NLR 组和高NLR 组癌组织中EGFR 表达变化

3 讨 论

炎症可诱导血管生成、细胞增殖、活性氧化物引起的DNA 损伤，并抑制癌细胞的凋亡［9-10］。在肿瘤微环境（tumor microenviroment，TME）中，肿瘤细胞重编程周围的基质细胞，导致炎症反应，不同的免疫细胞膨胀和募集，促进癌症进展［11］。中性粒细胞通常反映患者全身炎症情况，淋巴细胞是患者特异性免疫应答的重要部分，NLR 可间接反应患者炎症/免疫状态，衡量促肿瘤/抗肿瘤炎症反应之间的平衡关系，当动态平衡被打破，会引起肿瘤的发生发展［12］。

研究表明，肿瘤细胞可以募集并激活中性粒细胞，称为肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANS）［13］，TANS 可通过降低CD4+/CD8+细胞比例并抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的产生，形成免疫抑制微环境，促进肿瘤的生长、转移等，还可以分泌表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）破坏基底膜并侵入周围组织，促进肿瘤生长、侵袭和转移。此外，肿瘤相关中性粒细胞可能通过弹性基质酶、基质金属蛋白酶等［14］，促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移，抑制宿主对恶性肿瘤的免疫反应，使肿瘤细胞的生长不受控制。

中性粒细胞与淋巴细胞比值已被证实是多种肿瘤，如胃癌［15］、卵巢癌［16］、膀胱癌［17］化疗效果的预测指标。Tachinami 等［18］研究指出，NLR 可作为复发性或转移性OSCC 患者接受纳武利尤单抗治疗效果的预测指标。Sánchez-Canteli 等［19］研究也表明，NLR 与头颈部鳞状细胞癌化疗疗效存在相关性。尼妥珠单抗是靶向EGFR 的单克隆抗体，能与EGFR 的胞外区特异性结合，阻断其信号传导，从而抑制肿瘤增殖，促进肿瘤细胞凋亡。本研究中对局晚期OSCC 患者使用尼妥珠单抗联合TP术前新辅助化疗方案，多数患者可达到临床部分缓解，根据所得NLR 最佳截断值将其分为高、低NLR 组；低NLR 组共24 例，达到治疗有效（CR+PR）者共20 例，RR 83.33%。高NLR 组共35 例，达到治疗有效（CR+PR）者共11 例，RR 31.30%，差异有统计学意义。本研究结果显示，术前外周血炎症指标对于局晚期OSCC 患者尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗疗效具有一定的预测意义，低NLR 组尼妥珠单抗联合TP 化疗效果优于高NLR 组，这与Wang等［20］在局晚期胃癌中的研究结果相似。

此外，患者接受化疗后NLR 整体呈下降趋势，即中性粒细胞绝对值相对减少或淋巴细胞绝对值相对增加。可能是因为患者接受化疗后，改善了机体的免疫功能、营养状态。Yi 等［21］在肺癌中的研究也发现这一规律，当患者接受2 个周期的化疗后，NLR 明显下降。Liu 等［22］研究表明，化疗后维持低NLR 水平的患者有更好的化疗疗效和预后，而NLR 增加的患者总生存期缩短。NLR 是一个动态变化的指标，受炎症、免疫状态及治疗方案的影响，其动态变化可能会影响治疗及预后。Kim 等［23］在乳腺癌的研究发现，治疗前和治疗后NLR 持续较低及NLR 发生变化的患者较NLR 持续较高的患者有更好的预后。Skórzewska 等［24］在胃癌中发现，治疗前NLR 较高者，肿瘤消退率较差，而治疗后NLR 增加的患者，对治疗无反应的风险增加。

尼妥珠单抗因其靶向性强，亲和力高，目前已广泛应用于临床，在头颈部鳞癌、食管鳞癌、肺癌等多种肿瘤中显示较好的疗效及安全性［25-26］。研究表明，抗EGFR 单抗联合化疗可下调癌组织中EGFR 的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖［27］。本研究免疫组织化学染色结果显示：高NLR 组、低NLR组尼妥珠单抗联合TP 化疗后EGFR 的表达都出现下降，且低NLR 组下降幅度较高NLR 组更大，提示使用尼妥珠单抗联合TP 术前新辅助化疗方案后，低NLR 组治疗效果更好。

NLR 与OSCC 患者预后的关系也被广泛研究，但对OSCC 患者的预后价值仍不明确，这可能与样本量、肿瘤部位及研究中使用的临界值差异有关。Ng 等［28］研究表明，NLR 较低的患者有更好的疾病控制率和总生存率（overall survival，OS），Rodrigo等［29］研究结果也证实以上观点；Marta 等［30］研究表明，NLR 是预后不良的独立预测因子。Takenaka等［31］发现有2/3 的研究表明，较高的NLR 与预后不良相关，但其他研究结果不显著。另外，Ye 等［32］未发现治疗前NLR 与HNSCC 存活率之间存在关联；Templeton 等［33］报道NLR 对预后的影响可能取决于部位。高NLR 与预后不良的相关机制尚不清楚，确定NLR 与肿瘤预后相关性的最佳临界值可能是将该血液学标志物转化为临床实践的先决条件。Yang 等［7］研究表明，高NLR 与淋巴结转移、较高的T 分期、肿瘤分化程度差、神经侵犯等临床病理特征相关。本研究未发现高、低NLR 组间临床病理特征存在差异，可能与样本量较少有关。此外，有研究指出，NLR 还可预测早期舌鳞状细胞癌颈部淋巴结转移的发生，Salzano 等［34］回顾性分析了100例早期舌鳞状细胞癌，当NLR 大于2.93 时，隐匿性淋巴结转移的风险增加。

综上，尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗具有良好的抗肿瘤作用，能够达到缩小肿瘤、临床降期的目的。使用新辅助治疗前外周血指标NLR 预测新辅助治疗疗效具有可行性，与其他肿瘤的研究结果一致［35］。新辅助治疗前不同的NLR 与疗效存在差异，较高的NLR 意味尼妥珠单抗联合TP 新辅助化疗近期疗效较差，新辅助治疗前外周血NLR 对疗效预测有一定的价值，并且简便易得，但仍需要进一步的前瞻性研究，同时扩大样本量证实其差异性并得到准确的临界值，以供临床参考。

【Author contributions】Tian LL processed the research, collected,analyzed the data and wrote the article.Nan XR designed the study,guided and critically reviewed the article structures.All authors read and approved the final manuscript as submitted.