结合科研背景对试题深入分析——以2023年广东卷20题为例

裴 柳

(河北省石家庄市第一中学)

结合真实、适切的科研背景,依托科学实验和探究情境所命制的试题,有利于全面考查学生的科学思维,如2023年广东高考卷第20题。教师讲评本题从突变体研究背景的视角,结合真实的实验对该题进行分析,有助于学生理清思路、突破疑难。

【原题呈现】种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:

(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与________植株的种子大小相近。

(2)用PCR反应扩增DAI基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和________进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备________。

(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。

图1

①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________。

②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。

③将②中选出的T2代阳性植株________(填“自交” “与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。

为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息如图2,在电泳图(图3)中将酶切结果对应位置的条带涂黑。

图2

图3

参考答案：(1)野生型 (2)载体 启动子和终止子 (3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因 ②75 ③自交 100 见图4

图4

在分析该题时,往往会产生诸多疑惑,如:“目的基因稳定遗传的植株”与野生型表型相同,为什么还要进行转基因培育和筛选该类型植株?为什么导入目的基因的同时还要导入卡那霉素抗性基因?T2代和T3代培养基都有阳性率约100%的幼苗,为什么不是从T2代而是从T3代挑选?这些问题虽然没有被命题人设置为考查角度,但是从突变体的科研视角对其分析和释疑有利于开拓思路,提升学生分析和解答问题的能力,同时让学生感受到科研工作所具有的严密的思维和严谨的态度。

疑点1.为什么自然界中有野生型还要通过基因工程将DAI基因导入隐性突变体中?

该试题相关背景是对拟南芥突变体的科学研究。其研究思路:首先对野生型拟南芥进行诱变(实验室常用甲基磺酸乙酯作为诱变剂对拟南芥的种子进行诱变),以种子的大小为观察指标,筛选出突变体。在科研中通常采用高通量测序法(一次并行对几十万至几百万DNA分子进行序列测定)对相关品系拟南芥的全部基因进行测序,通过数据分析,找出突变体中发生改变的基因——突变的DAI基因,然后对该基因的遗传信息进行研究,确定了突变是由正常基因的一个碱基G替换为A所致。进而通过杂交实验明确了该突变为隐性突变。研究至此只是初步证实了突变体的形成与DAI基因发生隐性突变有关。为进一步增加其可信度,明确该基因与突变性状的关联性,科学研究中通常还需进行恢复实验。

该突变体的恢复实验是将单一DAI基因转入突变体基因组中,若将正常DAI基因记作M,突变的DAI基因记作m,需先筛选出基因型为Mm的植株,其自交后得到基因型为MM的品系即为恢复系。恢复实验的设计思路类似“某种元素是植物必需元素的验证实验”:在植物缺素培养出现缺素症后,再添加该元素,观察缺素症是否得到明显缓解。

突变体在自然界中很常见,在遗传学研究中更是被广泛应用,如拟南芥超过90%的基因都具有突变体。在突变体研究中,恢复系植株具有重要用途,如利用恢复系和野生型分别对目的基因进行PCR,获得该基因拷贝数,若比对结果极其接近或基本一致,就可从基因数量水平证明突变体是野生型的两个目的基因均发生隐性突变所致;在每批突变体材料的表型观察或进行其他实验时,需要野生型和恢复系分别做对照,故有必要筛选出能稳定遗传的恢复系植株并对其进行扩大培养。

疑点2.为什么导入目的基因的同时还要导入卡那霉素抗性基因?如何保证两个基因同时导入和表达?

利用农杆菌转化法进行转基因时,只有农杆菌Ti质粒上的T-DNA片段才能转入到受体细胞的染色体中。用于筛选拟南芥细胞、植株或种子的标记基因也需要和目的基因一并导入受体中。该试题中的卡那霉素抗性基因作为标记基因,通过在培养基中添加卡那霉素选择出导入目的基因的种子。

为了使两个基因均构建在T-DNA片段中,可将两基因进行拼接,该过程如图5所示。获取拼接基因需设计两对引物,引物A、B为常规引物,且这对引物位于两基因的非拼接端,而引物C、D位于两基因的拼接端,且在这对引物的5′端增加一段互补序列。这样PCR1和PCR2的产物,可以通过引物C、D的互补序列进行配对,使前两轮复制得到的两条DNA单链分别作为PCR3的“模板和引物”,扩增出拼接基因。之后将拼接基因导入农杆菌T-DNA的相应启动子和终止子之间,借助农杆菌的侵染将拼接基因连接到拟南芥染色体上,实现DAI基因和卡那霉素养抗性基因在受体细胞中共同表达。

图5

农杆菌转化的拟南芥(T0代)中有多种基因型:没有发生转化的mm基因型、插入一个位点的Mm基因型、插入两个位点的MM基因型、插入三个位点的MMM基因型等。这些种子播种在含有卡那霉素选择培养基上,基因型为mm的阴性植株不能萌发,而能够萌发并生长的阳性个体基因组中均插入了M基因,借此操作筛选出导入目的基因的植株。

疑点3.为什么从T3代种子中挑选目标转基因植物而非从T2代种子中挑选?

这里涉及题目(3)①-③中所述每一代操作的主要目的和株系育种法。株系是由同一植株繁殖而来的后代。通常做法是选择某植株单株收获种子,播种在一个单独区间,这个区间所有植株称为一个株系。与普通杂交育种相比,分株系种植可尽快达到鉴定和分离纯系的目的。

该试题中拟选出单一位点插入的植株,并获得纯合体。结合题目信息分析T0→T1代的目的是筛选出插入了拼接基因的植株;T1→T2代目的是筛选出插入单一位点的植株:T2代种子阳性率为3/4的种子即为插入单一位点的植株,其T0代插入位置有两种可能,如图6中图a和图b所示,此时将T2代种子按单株收种并播种于选择培养基中,所得T3代株系全部为阳性表型,即为想筛选的突变体恢复系。

图6

疑点4.为什么选单一位点插入野生型DAI基因的突变体?

该试题中用单一位点插入野生型DAI基因的突变体,到T3代可选出基因型为MM的恢复系。如果转入两个或两个以上M基因(如图7),因自交后代均为阳性,而无法区分导入M基因的个数。

图a

同时由于基因的拷贝数可能会影响基因的表达进而影响对性状的控制,因此筛选出和野生型一致的转基因纯合体,即通过筛选单一位点插入野生型DAI基因的突变体,进一步获得的基因型为MM品系(恢复系)才最符合科研需求。

除了上述所呈现的问题,相关科研背景还可从以下角度切入:利用“不同浓度的卡那霉素对拟南芥萌发的影响”等与该试题中实验密切相关的一系列实验,学习获得拟南芥突变株的常用方法[如通过甲基磺酸乙酯诱变(ems)法诱变、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术诱变等],以及利用PCR、RT-PCR 等方法对突变体进行分子水平鉴定的流程等。

教学虽然不是科研,但了解科研背景和科研事实,学习实验方法,不仅可以在分析试题时清楚了解出题背景和命题立意,透彻地解析疑点,还能通过科研视角的切入和科研意识的渗透,在学生心中埋下科研的种子。