大黄素联合紫杉醇治疗非小细胞肺癌的作用机制探讨

王潘红 郑明 蔡云峰

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，据2019年美国相关统计数据表明NSCLC约占所有肺癌患者的85%［1-2］。大黄素是中药大黄、何首乌和虎杖中的主要有效成分，现代药理研究表明其具有抗癌抗肿瘤、抗炎、镇痛、保护器官等多种药理作用，因其抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的突出作用多用于抗癌的相关研究中［3-5］。紫杉醇是由红豆杉中提取出的二萜类植物抗肿瘤药物，因其抗瘤疗效、延缓肿瘤进展和过敏反应较低等优势临床上广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗［6-8］。本研究探讨大黄素联合紫杉醇治疗NSCLC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌细胞株A549购自美国典型生物收藏中心；DMEM高糖培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司、MTT粉剂及二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒（TP53批号：202004，CASP3批号：202007）购自南京碧云天科技公司；多功能酶标仪，美国Molecular Devices有限公司，型号：M5。

1.2 方法 （1）大黄素联合紫杉醇的成分-靶点网络构建：在研究中药分子机制的在线生物信息学分析工具TCMSP以及医药信息查询库药智数据中输入“大黄素”、“紫杉醇”搜集两者的所有化学成分及靶点，将得到的数据建立大黄素联合紫杉醇的化学成分-靶点数据库，输入Cytoscape 3.7.0软件以建立大黄素联合紫杉醇的成分-靶点网络。（2）大黄素联合紫杉醇与NSCLC的PPI网络构建：通过GeneCards（http：//www.genecards.org/）数据库获取NSCLC相关的疾病基因，然后在EXCEL中应用“VLOOKUP”函数筛选出大黄素联合紫杉醇与NSCLC的交集靶点。根据获得的交集靶点数据输入STRING数据库中，将物种仅限于智人（Homo sapiens），置信度得分＞0.4，构建蛋白相互作用网络 （PPI），并寻找PPI网络的核心靶点。（3）靶点的生物学功能及通路分析：将1.2中得到的大黄素联合紫杉醇-NSCLC交集蛋白靶标基因输入Cytoscape中的ClueGo插件进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，仅考虑P值＜0.05的生物学功能和富集通路，分析大黄素联合紫杉醇作用于NSCLC的潜在生物学功能及相关通路。（4）MTT法检测细胞活力：分为空白对照组、大黄素组、紫杉醇组与联合用药组，待A549细胞处于生长对数期时接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养过夜贴壁后，空白对照组加入含胎牛血清（10%）的DMEM培养基处理48 h，大黄素组分别加入30μmol/L、60μmol/L、90μmol/L 的大黄素溶液处理48 h，紫杉醇组分别加入0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L的紫杉醇溶液处理48 h，联合用药组加入90μmol/L大黄素分别联合0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L 的紫杉醇溶液处理48 h。每孔加入20μL 5 mg/mL MTT液继续培养4 h后吸弃培养液，加入150μL DMSO于室温下振荡10 min，然后用酶标仪选定490 nm波长测定OD值。每组设6个复孔，然后根据公式计算抑制率：肿瘤抑制率=（1-药物组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。（5）酶联免疫吸附试验（ELISA）：分为空白对照组、大黄素组、紫杉醇组与联合用药组，待A549细胞处于生长对数期时接种于96孔板中，37℃、5% CO2培养过夜贴壁后，空白对照组加入含胎牛血清（10%）的 DMEM 培养基培养48 h，大黄素组加入90 μmol/L的大黄素溶液处理48 h，紫杉醇组加入0.2 μmol/L 的紫杉醇溶液处理48 h，联合用药组加入90 μmol/L大黄素联合0.2 μmol/L紫杉醇溶液处理48 h。按照上述分组给药后收集各组细胞上清液于4 ℃ 3,000 r/min 离心10 min，然后吸取上层清液，按照试剂盒中的步骤用酶标仪分别测定样品的吸光度，计算相应的CASP3、TNF-α的水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建立成分-靶标网络 从TCMSP和药智数据数据库中筛选出大黄素联合紫杉醇的41个靶标基因，应用Cytoscape 3.7.0软件构建成分-靶点网络，获得所示43个节点和41个边缘的目标网络。见图1。

图1 大黄素联合紫杉醇成分-靶点网络图

2.2 靶点-靶点互作网络 应用GeneCards数据库，获得关于NSCLC的4,910个疾病相关基因，采用EXCEL函数筛选出大黄素联合紫杉醇与NSCLC的共同靶点基因32个。将32个共同基因输入STRING，获得31个节点、149个边缘的靶点—靶点互作网络（见图2）。选择具有高度连接性的前10个靶基因作为中枢基因。大黄素联合紫杉醇在NSCLC发展过程中可能发挥重要作用的是细胞肿瘤抗原p53（TP53）、半胱天冬酶3（CASP3）、肿瘤坏死因子（TNF）、前表皮生长因子（EGF）、前列腺素G / H合酶2（PTGS2）、Myc原癌基因蛋白（MYC）、血管内皮生长因子受体2（KDR）、转化生长因子beta-1（TGFB1）、基质金属蛋白酶9 （MMP9）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）。

图2 大黄素联合紫杉醇-NSCLC靶点-靶点互作网络

2.3 GO与KEGG富集分析 GO富集分析由生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）三部分组成。应用Cluego将293个靶点基因上传到数据库，获得GO和KEGG通路信息。见图3-4。GO分析共得到150个生物学过程，前10个生物学过程见表1。KEGG通路分析得到45条相关通路，前10个相关通路见表2。

表1 GO分析前10个生物学过程

表2 KEGG分析前10个通路

图3 大黄素联合紫杉醇-NSCLC共同靶点GO分析图

图4 大黄素联合紫杉醇-NSCLC共同靶点KEGG分析图

2.4 大黄素联合紫杉醇对A549增殖的影响 90 μmol/L大黄素+0.1μmol/L紫杉醇与90μmol/L大黄素+0.2 μmol/L紫杉醇对A549的抑制率明显高于其他各组（P＜0.05）。见表3。

表3 不同浓度大黄素及大黄素联合紫杉醇对A549增殖的比较

2.5 ELISA检测CASP3、TNF-α水平 由上述结果可知90μmol/L大黄素和0.2μmol/L紫杉醇这两个浓度效果最好，因此选取这两个浓度分成单用与联用三组。与空白对照组相比，大黄素组、紫杉醇组与联合组CASP3含量明显增加（P＜0.05），联合组CASP3含量高于大黄素组和紫杉醇组（P＜0.05）。与空白对照组相比，大黄素组、紫杉醇组与联合组TNF-α含量明显降低（P＜0.05），紫杉醇组TNF-α含量低于大黄素组，联合组TNF-α含量低于大黄素组和紫杉醇组（P＜0.05）。见表4。

表4 大黄素、紫杉醇以及两药联合对CASP3、TNF-α水平的影响（±s）

表4 大黄素、紫杉醇以及两药联合对CASP3、TNF-α水平的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与大黄素组比较，#P＜0.05；与紫杉醇组比较，△P＜0.05

组别nCASP3（ng/L）TNF-α（ng/L）空白对照65.96±0.36101.25±3.35 90μmol/L大黄素67.75±0.65*79.57±2.78*0.2μmol/L紫杉醇67.99±0.31*70±2.69*#90μmol/L大黄素+0.2μmol/L紫杉醇610.91±0.43*#△52.01±1.98*#△

3 讨论

目前临床上针对NSCLC的治疗方法主要有手术治疗、放化疗、分子靶向药治疗、中药治疗等，其中约80%的患者诊断时即为晚期无法接受手术治疗，放化疗及分子靶向药物存在耐药现象和毒副作用等问题，中药治疗NSCLC具有多靶点的优势，且毒性较低，受到国内外学者的广泛关注［9］。紫杉醇是一种广谱抗癌药物，已被证实对于多种癌症如NSCLC、卵巢癌、乳腺癌等均有明显作用，但因其耐药性及毒副作用的问题使紫杉醇在临床应用方面受到限制［7］。有研究表明大黄素能够有效抑制NSCLC细胞增殖，在减少化疗药物耐药性方面具有较好的应用前景［10］。

MTT结果表明，大黄素联合紫杉醇有抑制A549细胞增殖的作用，且联合用药抑制率高于大黄素及紫杉醇单独用药，提示大黄素联合紫杉醇治疗NSCLC具有一定潜力。网络药理学结果表明，大黄素联合紫杉醇作用于NSCLC的潜在靶基因主要有TP53、CASP3、TNF等。研究表明肿瘤抑制基因TP53突变状态作为NSCLC治疗反应的预测标志和生存预后标志起到一定作用，同时与NSCLC患者总体存活率较低有关［11］。有研究表明CASP3基因表达降低的NSCLC患者总体存活率明显较低，其中CASP3（-1337C＞G）多态性可能参与NSCLC的发生发展［12］。有研究结果显示，TNF-α在NSCLC患者癌组织中高表达，表明TNF-α与NSCLC的发生发展密切相关［13］。ELISA结果表明，大黄素与紫杉醇联合能明显增加A549细胞CASP3含量，降低TNF-α含量，提示大黄素联合紫杉醇可能通过调控CASP3、TNF-α水平作用于NSCLC。从GO富集分析结果可知，大黄素联合紫杉醇是通过调节细胞增殖与凋亡、调控基因表达等多个生物学过程发挥抗NSCLC作用，这也体现在机制研究所涉及的信号通路中。KEGG 分析结果涉及MAPK 信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等，可能与 NSCLC的生长和抑制密切相关。

综上所述，大黄素联合紫杉醇可能通过调控CASP3、TNF-α等多个靶点以及调节细胞增殖与凋亡、调控肿瘤抑制基因表达、炎症反应等多个生物学功能或途径对NSCLC起到治疗作用。