橙皮苷通过抗炎和抗氧化对骨质疏松大鼠模型的影响＊

义明东，唐新桥，张 强

（南华大学附属湘潭市中心医院 湘潭 411100）

骨质疏松症（Osteoporosis）是一种消耗性的疾病，主要机制是破坏骨质及骨骼的微结构功能[1-2]；骨折是其主要并发症，常因一些无关紧要的小损伤引发骨折，严重降低了骨质疏松症骨折患者的生活质量；有文献表明，目前世界上因骨质疏松症引起的骨折患者超过890 万例/年[3]。但是，单纯的骨质疏松症极易被忽视，导致诊断及治疗不及时。骨质疏松症受到各种危险因素的影响，包括家族史、性别、酗酒和滥用药物、饮食和锻炼以及女性的雌激素水平。绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis，PO）是骨质疏松症的一种特殊类型，指由绝经引起的相关雌激素戒断所引发的骨质疏松症；其主要特征是伴随着雌性激素的进行性下降，导致骨量降低和骨微结构破坏，最终使得骨脆性增加，其发病率逐年上升，已经成为全世界绝经后老年女性的主要健康问题之一[4-5]；给全世界绝经后女性患者及家庭带来了极大的困扰。据估计，2010 年在美国，有多达1020 万65 岁及以上的成年人患有骨质疏松症，预计每年都会增加[6]。毫不奇怪，年度骨质疏松症总体发病率上升后，绝经后骨质疏松症患病率也会有一定程度的增加[7]。因为这些事件每年的死亡率为20%[7]。根据流行病学研究，2010 年生活在欧洲联盟的2200 万妇女和550 万男子患有骨质疏松症[8-9]，有超过350 万的新残疾妇女得以维持[10]。特别值得一提的是，预计在印度这个国家里，50 岁以上人口总数增幅最高，从2013 年的1.2 亿增加到2050 年的6.2 亿[11]。在埃及，有报告表明，绝经后妇女中存在骨质疏松症（28.4%）和骨量减少（53.9%），并且全球范围内其发病率也呈上升趋势[4]。

及早预防及治疗骨质疏松症是降低绝经后妇女骨折并发症的风险的最佳治疗方案[3]；当今临床上用于治疗骨质疏松的药物种类繁多，如降钙素、二膦酸盐类、甲状旁腺激素及雌激素替代疗法等药物，包括阿仑膦酸钠（Alendronate，AN）在内的二膦酸盐是目前临床上治疗绝经后骨质疏松症的一线药物。但骨质疏松症是一种长期的病理过程，常常需要进行长期的治疗[3]，导致药物不良反应的发生率及严重程度大大的增加，例如增加心脑血管意外发生的风险、胃肠道反应、神经系统疾病，并易引发各类癌症的扩散或发展[3]。在21 世纪后，世界各国对骨质疏松症治疗的医学研究越来越多，但是各国的药理学家发现，目前临床上治疗骨质疏松症的药物基本上都比二膦酸盐类药物有着更多的副作用和器官毒性。有充分的证据证明雌激素替代疗法（Estrogen replacement therapy，ERT）对老年和绝经后妇女的骨质疏松症发挥抗骨质疏松的作用[1]，不幸的是，连续的使用ERT 具有严重的副作用，例如乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌的发生或进展加速[1]。因此，需要新的药物来预防或治疗绝经后骨质疏松，或者减轻副作用。故进入21 世纪后，各国的药理学家深入的探索了骨质疏松症的治疗及预防新方法。

大量文献表明炎症反应和氧化应激反应过度是绝经后妇女易患骨质疏松症重要的发病机制[2,5,12]。绝经妇女的共同特征是体内抗氧化剂水平的降低及氧化应激反应过度，并且机体发生氧化应激后，可以使体内的炎症因子水平升高；氧化应激反应一般是因自由基的过量产生、机体内源性抗氧化机制表达水平降低或体内炎性分子水平的增加而增加[12]。骨代谢指标及骨周转换标志物指标可体现骨转换速度的水平，显示骨质疏松的程度。橙皮苷（Hesperidin，HP）是陈皮、柑橘等柑橘属植物果实中的主要化合物，同时也是主要的药效成分[13]；具有多种多样的药理活性，例如抗炎、抗氧化、改善微循环、抗高胆固醇血症、抗癌的作用。橙皮苷的抗炎、抗氧化和改善微循环的作用已通过各种研究报告，使用各类分析系统进行了报道[13-15]。橙皮苷在动物模型及动物实验中已被证明可通过降低炎性细胞因子水平和抗氧化作用来减轻炎症反应及其所导致的疼痛反应[16]。同时，橙皮苷在紫外线B辐射引起的皮肤损伤的小鼠模型中，被证明有着抗氧化应激和抗炎的作用[17]，这是通过下调机体所分泌的炎性细胞因子包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6[18]来发挥作用。其可通过多途径对绝经后骨质疏松症产生影响，且暂未有文献或实验证明橙皮苷具有明显的副作用，临床上目前越来越多的把橙皮苷用于绝经后骨质疏松症的辅助治疗，是预防和治疗绝经后骨质疏松的潜在药物；但橙皮苷的作用机制仍未探索完善，近年来，各国的药理学家对橙皮苷治疗绝经后骨质疏松的作用机制的研究越来越多。橙皮苷可以抑制破骨细胞的分化[19]；但针对于抗炎及抗氧化机制所发表文献及实验较少。本实验通过建立摘除双侧卵巢诱导骨质疏松的大鼠模型并用各种浓度橙皮苷来干预，设立正常及OVX 对照组及AN 的干预作为对照，观察橙皮苷对OVX大鼠模型的炎症因子及超氧化物指标变化，探讨橙皮苷通过抗氧化和抗炎机制在绝经后骨质疏松症的抗骨质疏松作用。

1 材料与思路

1.1 实验材料

本实验中使用的主要实验材料见表1。

表1 实验材料

1.2 研究思路

具体实验研究思路见图1。

图1 实验研究思路

2 方法

2.1 实验方案

2.1.1 模型的建立

手术之前将SD 大鼠在正常条件下饲养4周，在进行手术前，让SD 雌性大鼠适应代谢笼环境7 天，自由进食和水；然后，将大鼠随机分为假手术组（Sham 组）和OVX 组；所有的实验性手术均在戊巴比妥（50 mg·kg-1）麻醉状态下进行。随后将OVX 组大鼠进行双侧去卵巢手术，将Sham 组大鼠进行假手术；并在标准实验条件下继续饲养4 周，以成功建立OVX 大鼠模型；4周后随机选择12 只OVX 及假手术组大鼠（各6 只大鼠），通过使用骨密度仪统一测定其距髁间窝约4 mm附近干骺端的骨密度（Bone mineral density，BMD，g·cm-2）来验证OVX大鼠模型建立成功。

2.1.2 实验方案

将30只OVX 大鼠随机分为5组，用来验证模型建立成功的正常雌性大鼠6 只为正常对照组，共6 组；具体分组及处理如下：Sham组：Sham大鼠+1% CMC混悬液；模型组：OVX 大鼠+1% CMC 混悬液；HP1 组：OVX大鼠+5 mg·kg-1HP；HP2 组：OVX 大鼠+10 mg·kg-1HP；HP3 组：OVX 大鼠+20 mg·kg-1HP；AN 组：OVX 大鼠+2.5 mg·kg-1AN。

各组大鼠均使用1% CMC 混悬液作为溶媒剂，通过上述的药物及浓度，保证每只大鼠每日入量一致，在每日早晨经口灌胃给所有大鼠，均在手术后第4 周开始给药，共持续10周。每只大鼠在被处死前均置于在代谢笼中24 h；从所有大鼠的腹主动脉中收集血液样品，并离心分离血清，将血清样品保存在-20℃的标本柜中；用来测定不同的生化参数。立即将各组大鼠称重；处死后，去除所有大鼠的左股骨，包裹股骨，将股骨储存在-20℃的标本柜中；用来测定骨密度和进行生物力学分析。

2.2 骨钙磷平衡指标的测定

2.2.1 血清钙离子测定

采用甲基麝香草酚蓝（Methyl thymol blue complexon， MTB）法测得Ca2+水平；用储存的血清测定钙水平，按生化试剂盒说明书操作，通过在酶标仪仪器上测定520 nm的吸光度来计算游离钙浓度。

2.2.2 血清磷离子测定

采用钼酸铵分光光度法测得血清磷离子（P5+）的水平；同样用储存的血清测定磷水平，按生化试剂盒说明书操作，通过在酶标仪仪器上测定660 nm 的吸光度来计算血清中磷的含量。

2.3 血清炎性分子水平的测定

使用ELISA 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（Interleukin-6，IL-6）的水平；使用储存的血清，严格按照ELISA 试剂盒的说明书来操作，并且通过酶标仪测定450 nm 处的吸光度值测定血清IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。

2.4 骨氧化应激因子的测定

取出储存的股骨，在冷0.9%生理盐水中匀浆，达到匀浆（10%），然后在离心机中以15000 r-min 离心，获得澄清的上清液。

2.4.1 TBARS的测定

采用TBAR 法估计骨氧化应激酶硫代巴比妥酸反应物质（Thiobarbiturates，TBARS）；在生化试剂盒中，加入不饱和脂肪酸的氧化产物醛类和实验标本，生成有色物，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记，通过酶标仪测定最大吸收峰于450 nm 处的吸光度，计算大鼠左股骨中TBARS的水平。

2.4.2 GSH、GPx的测定

使用DTNB 法测得谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、谷胱甘肽过氧化氢酶（Glutathione peroxide，GPx）的水平；严格按照生化试剂盒说明书操作，加入一定量的DTNB 试剂和实验标本，生成的复合物，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记，在412 nm处有特征吸收峰；并且吸光度与GSH含量成正比，与GPx含量呈反比；412 nm处吸光度的上升即可反应GSH 的活性。412 nm 处吸光度的下降即可反应GPx 的活性；可测得大鼠左股骨中GSH和GPx的水平。

2.4.3 GR、GST和CAT的测定

采用紫外吸收法测定谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）、谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）的水平；将实验标本分别与GR 测定液、GST 测定液、CAT 测定液混匀；通过酶标仪测定240 nm 波长的初始吸光度和1 min 后的吸光度。计算两者间的差值，即可测得大鼠左股骨中GR、GST、CAT的水平。

2.5 骨周转换指标的测定

在骨转换指标试剂盒中采用ELISA 法测得大鼠血清中骨特异性碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、β 胶联降解产物（β-Crosslaps，β-CTX）和酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）的水平和血清骨钙素（Osteocalcin，OC）的活性；分别将预先包被人骨特异性碱性磷酸酶（B-ALP）捕获抗体、人骨特异性碱性磷酸酶（B-ACP）捕获抗体、人骨特异性碱性磷酸酶（β-CTX）、人骨特异性骨钙素（OC）捕获抗体加入96孔板中，设置样本孔和标本孔，分别加入标准品和实验标本，再加入HRP 标记的检测抗体，通过酶标仪检测在450 nm 波长的吸光度，就可以计算出血清中ALP、ACP、β-CTX和OC的水平。

2.6 骨密度测量

骨密度分为面积骨密度和体积骨密度；面积骨密度是指所测单位面积所含有的骨矿物质。使用储存的股骨以1 mm·s-1的速度在数字DR 双能X 线骨密度测试仪上测得大鼠左股骨的面积骨密度，用g·cm-2来表示大鼠的BMD。

2.7 生物力学的评估

通过进行三点弯曲实验测定大鼠左股骨的生物力学参数。在三点弯曲实验仪器上的测试件中间及两端位置分别测量测试件的长、短外径，然后将制备好的大鼠左股骨放置于仪器的支座上，以测试件与支座的接触为点接触，其横截面短轴的方向与载荷方向一致，记录位移（mm）和中心载荷；直至骨折发生在骨中。可用此方法测定杨氏模量（Young’s mod）、最大应力（Maximum load）、最大载荷（Maximum load）和能量吸收（Engergy）的水平。

2.8 SIRT1基因检测

2.8.1 逆转录PCR

采用cDNA 分离试剂盒，以大鼠股骨作为标本常规提取RNA，使用逆转录PCR 法进行1 步PCR：37℃15 min，最后85℃ 5 s，使酶变性失活，最后4℃保存10 min。沉默调节蛋白1（Recombinant Sirtuin 1，SIRT1）基因上游引物：5’-CCAGATCCTCAAGCCATG-3’，下游引物：5’-TTGGATTCCTGCAACCTG-3’。

2.8.2 PCR检测

PCR 检测按照试剂盒说明书进行，PCR 反应条件：第一步95℃预变性30 s；第二步95℃变性5 s，第三步60℃退火40 个循环，每个循环31 s，最后进行溶解阶段。所有结果经GAPDH 内参校正后，ΔΔCt 法计算最终结果并采用2-ΔΔCt表示。

2.9 统计学分析

3 结果

3.1 橙皮苷对大鼠体质量的影响

在各组大鼠治疗期间，Sham 组、OVX 各组大鼠均显示体质量增加；而经过HP 或AN 治疗后显著降低了大鼠的体质量增加量（P<0.001）（图2），且HP 的影响呈浓度依赖性（图2）；这些结果提示经过去卵巢手术后，雌性大鼠的体质量增加幅度较前显著增加，经过HP 及AN 处理后可有效的抑制大鼠体质量的增加幅度。

图2 HP对大鼠体质量增加水平的影响（±s）

3.2 橙皮苷对Ca2+和P5+的影响

在骨质疏松期间，测得Ca2+和P5+水平升高。实验结束后，与Sham 组大鼠相比，OVX 组大鼠均表现出增加的Ca2+和P5+（图3），HP 显著降低了Ca2+和P5+的水平（图3）（P<0.001）。同时，HP的影响呈浓度依赖性，AN组表现为类似的结果，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图3 HP对大鼠的血清Ca2+和P5+水平的影响（±s）

3.3 橙皮苷对炎性分子的影响

机体内炎症反应在骨质疏松发生进展和中起着重要的作用。与Sham 组相比，OVX 组大鼠均表现出炎性分子水平的升高：IL-1β、TNF-α 和IL-6（图4），HP 治疗组显著降低了OVX 大鼠IL-1β、TNF-α 和IL-6 的水平，且呈浓度依赖性影响（图4）。AN 组表现为类似的结果。差异具有统计学意义（P<0.001）。

图4 HP对大鼠的血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影响（±s）

3.4 抗氧化酶和氧化应激参数分析

OVX 组大鼠与Sham 组大鼠相比，氧化应激参数在骨质疏松期间表现为TBARS升高和GSH、GST、GR、GPx 和CAT 下降（图5）。HP 和AN 给药处理后均显著降低了OVX 大鼠的TBARS 水平和升高了OVX 大鼠GSH、GST、GR、GPx 和CAT 的水平，且呈浓度依赖性（图5），差异具有统计学意义（P<0.001）。

图5 HP对大鼠股骨TBARS、GSH、GST、GR、GPx和CAT水平的影响（±s）

3.5 骨周转换指标参数分析

下列各图表清晰的显示了各组大鼠在给药后骨转换指标参数的影响。OVX 组大鼠相比于Sham 组来说，表现为ALP、ACP、β-CTX 和OC 指标的升高（图6）。HP 显著降低了OVX 大鼠ALP、ACP、β-CTX和OC 的水平，且影响呈浓度依赖性（图6）。AN 组表现为类似的结果，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图6 HP对大鼠血清ALP、ACP、β-CTX和OC水平的影响（±s）

3.6 橙皮苷对骨密度的影响

各组大鼠之间BMD 的实验数据结果如图7 所示。与Sham 组大鼠相比，OVX 组表现出BMD 水平的下降（图7）。经过HP 给药处理后的各组大鼠显示了OVX大鼠BMD 水平的上调（图7），且影响呈浓度依赖性。AN 组跟HP 处理后结果类似，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图7 HP对大鼠股骨BMD水平的影响（±s）

3.7 生物力学参数分析

OVX 组大鼠表现为骨生物力学参数杨氏模量、最大应力、最大载荷和能量吸收减少，相对于Sham 组来说（图8）。OVX 诱导的大鼠用HP 给药处理后显著增加了杨氏模量、最大应力、最大载荷和能量吸收的水平（图8），而且影响呈浓度依赖性，AN 组表现为类似的结果，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图8 HP对大鼠股骨杨氏模量、最大应力、最大载荷和能量吸收水平的影响（±s）

3.8 PCR分析

与Sham组大鼠相比，OVX组大鼠表现出SIRT1的表达增加（图9）。HP 给药后大鼠显著以浓度依赖性的方式减少了OVX 大鼠SIRT1 的表达（图9）。AN 组表现为类似的结果，差异具有统计学意义（P<0.001）。

图9 HP对大鼠股骨SIRT1表达水平的影响（±s）

4 讨论

大量文献及研究证明，绝经后老年妇女因为机体的雌激素水平逐步下降，会导致骨形成的减少，从而破坏骨平衡，容易在组织的层面继发骨质疏松症，在机体内的发生发展通常需要长期的演变过程[5]。绝经后骨质疏松症的发生发展机理可以进行多方面的研究[3]，其治疗方案的研究也越来越多。绝经后骨质疏松症的直观病理机制是机体内雌激素水平下降和机体的衰老，主要在于增加了炎性因子的产生，发挥破骨细胞的特性；机体内的炎性因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）增加，放大了RANKL 的表达，通过这一机制表达的增加，促进体内破骨细胞的形成[20]。局部和全身性骨丢失也是炎症性风湿性疾病的标志，反映了骨和机体炎症反应发生之间相互作用的密切联系，导致破骨细胞过度激活，从而导致骨形成和骨吸收的解偶联。机体骨吸收作用的信号通路主要是核因子-κB（NF-κB）配体受体激活剂（RANKL）系统，其主要是由成骨细胞表达；它与破骨细胞前体和成熟破骨细胞上的受体RANKL 结合，诱导破骨细胞生成和骨吸收。SIRT1 基因的表达与NF-κB 配体受体激活剂（RANKL）系统的表达息息相关；此前研究表明，绝经后雌二醇水平的降低会导致血管内皮细胞功能障碍和促红细胞生成素水平降低[3]；而机体血流量与BMD呈正向相关关系并近乎同时发生[4]，说明体内雌激素水平的下降，可以引起血流量水平的变化，是骨质疏松症发生发展的一大危险因素。通过这一发病机制，表明增加骨骼内血液供应的有效植物成分及药物可能对治疗骨质疏松症有效；血清中的骨代谢（Ca2+、P5+、ALP、ACP、β-CTX 和OC）的水平变化情况可以反映机体骨转换的状态，体现机体的骨质疏松程度；血清中的炎性细胞因子指标及股骨的氧化应激因子及抗氧化酶指标可反映机体的炎性反应及氧化应激反应水平；骨密度和骨微细结构变化可以反映出骨量的变化，杨氏模量、最大应力、最大载荷和能量吸收的测定可以评估骨骼的骨质水平，SIRT1 基因的表达变化可以反映NF-kB 配体受体激活剂（RANKL）系统在机体内的表达水平。本实验以SD 雌性大鼠的骨密度、血清骨代谢指标、炎性因子、氧化应激因子、骨微观结果变化及SIRT1基因的表达为主要变化指标研究橙皮苷通过抗炎及抗氧化作用于去卵巢大鼠所起得的治疗效果。

骨质疏松症在骨折发生之前很难明确诊断，影像学表现也不明显，所以被称为是一种沉默的疾病[21]。从中医的角度分析，在数千年以前，各种各类的中草药就已被用于治疗各方面的疾病，特别是对慢性疾病，中草药不仅能促进骨折的愈合，而且安全性及性价比均比化学药品更高[22-24]，随着人们对骨质疏松症的新疗法的迫切需要，从中药里面发现潜在的骨活性化合物已经成为一个热门的研究领域；并且由于目前用于长期治疗骨质疏松症的临床药物所带来的的副作用，导致在世界范围内，中草药用于治疗绝经后骨质疏松已经成为21 世纪的研究热点之一。很多药理学家已经在开展中草药生物活性因子的作用及相关机制的研究，并取得一定的成果，HP 是柑橘属植物果实中的主要活性成分，是大量药理学家近年来研究出的可用于治疗绝经后骨质疏松的一种潜在药物[4-5,13-14]，是治疗绝经后骨质疏松的潜在药物之一。

多年来的研究已经证明了骨骼作为一个器官的核心作用，与其他几个组织不断地交换和调节[25]。普遍认为，骨骼具有运动、物理性的保护内部器官和调节矿物质稳态方面的作用，还可通过成骨细胞分泌骨钙素影响男性生育能力和认知功能[26-27]。在骨重塑过程中，机体可以通过靶向释放和掺入骨基质的方式，来维持机体血清内Ca2+和P5+之间的动态平衡[25]。重塑在整个骨稳态中的重要作用体现在有利于骨吸收，而不是有利于骨形成，骨重建受损是导致骨质疏松症等骨病理的基本病理生理机制[25]。正常人体及正常大鼠机体的骨质吸收和骨质形成是一个动态的平衡，而绝经后妇女容易继发骨质疏松，其原因是雌激素水平的下降，导致机体内破骨细胞增殖分化过于活跃，导致机体的骨重建失衡，使得机体骨吸收速度大于骨形成速度，抑制机体新骨的形成，最终导致骨质疏松，属于一种高转化性骨质疏松症。在本实验中，OVX 大鼠血清中的OC水平升高可以表明OVX大鼠新形成的成骨细胞处于活跃状态，而ALP、ACP 及β-CTX 水平的变化是反映机体骨形成和骨转换的重要生化指标。实验结果表明成功建立高转化性骨质疏松症模型，与绝经后骨质疏松症的临床特征相符，表明成功建立OVX骨质疏松症大鼠模型，可用来作为绝经后骨质疏松症的相关研究。

根据先前的研究，机体内的超氧化物主要包括活性氧（Reactive oxygen species，ROS）及活性氮（Reactive nitrogenspecies，RNS），主要是ROS 参与雌激素缺乏诱导的骨质疏松症[12]；过多的过氧化氢被认为是损伤细胞（包括软骨细胞）过程中的关键介质[28]；活性氧是有氧代谢的副产物，如羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。通过氧化还原反应产生的，并且是氧的活性衍生物[29]；在生理条件下，ROS作为信号分子参与调节不同的生物过程。H2O2对大鼠软骨细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，但加入HP 后抑制作用明显减弱[30]，来自动物研究的证据支持ROS 对骨骼健康的有害影响[31-35]。在该实验中，发现OVX 大鼠相对于Sham 组大鼠来说，增加了TBARS 的水平并降低了内源性抗氧化酶的水平；证实了雌激素缺乏可在一定程度上增强氧化应激反应。HP 能够通过激活或增加机体内源性抗氧化酶（GSH、GST、GR、GPx 和CAT）的活性，使得体内的氧化应激反应下降[36]，预防骨质疏松症。破骨细胞因子IL-6、IL-17、干扰素-γ、TNF-α、巨噬细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白-1等促进骨吸收、抑制成骨细胞[37]。IL-6 是多发性骨髓瘤中肿瘤浆细胞产生的重要破骨因子，也是绝经后骨质疏松症骨质丢失的主要预测因子[38]。TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17 等Th1 型促炎细胞因子的过度产生是继发性和原发性骨质疏松症的基础[37]。在实验中，OVX 组大鼠的促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平显著上升；HP 治疗可显著降低OVX 组大鼠的促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）水平；OVX 各组大鼠相对于Sham组大鼠，OVX 大鼠发生了骨质丢失并且机体内的氧化应激因子TBARS堆积升高且抗氧化酶水平下降，导致机体氧化应激水平升高。OVX 组大鼠经过HP 或AN的治疗，有效地清除了氧化应激因子TBARS，使抗氧化酶GSH、GST、GR、GPx 和CAT 升高；降低了机体的氧化应激水平，减轻了骨质的丢失并延缓了骨质疏松的发生，表明HP 对去卵巢大鼠骨质和骨量具有保护作用；这一实验数据与Olalekan 等[39]的数据一致，HP能显著抑制三氯乙烯诱导的果蝇体内ROS 的过量产生，提示其具有清除ROS的作用[39]，在很大程度上恢复了氧化还原和抗氧化平衡[39]。

在此实验中，OVX 大鼠由于雌激素缺乏可导致血钙及血磷水平升高，而经过HP 及AN 治疗后大鼠的血Ca2+和P5+水平有所下降，可以有效的治疗骨质疏松症。此前的文献显示，血Ca2+水平的增加可能是由于改变了肠道内源性抗氧化剂状态，促进了肠道对Ca2+的吸收[3]。骨周转换物的指标可反映骨形成功能，在此实验中，显然，OVX 大鼠的骨周转换物质水平上升，相对于Sham 组来说，HP 可以有效的通过降低骨周转换物来治疗骨质疏松症。BMD 是指单位组织或器官内矿物质的含量，BMD 是反映骨量的主要指标，也是决定骨强度的主要因素，骨骼骨密度水平的变化可以反应出骨量的细微变化。OVX 组大鼠的BMD 水平相对于Sham 组大鼠明显降低，HP 及AN 治疗后OVX 大鼠BMD 显著升高，表明了HP 能有效地增加OVX 大鼠的骨量。三点弯曲实验可以精准的反映骨骼的弯曲功能，而相关生物力学参数（杨氏模量、最大应力、最大载荷和能量吸收）均可通过三点弯曲实验测得，在此实验中，OVX 组大鼠的生物力学参数有着显著的下降，而经过HP 及AN 治疗后，OVX 大鼠的生物力学参数有着明显的提升。进一步表明了HP 具有抗骨质疏松作用。以前的研究表明[41]SIRT1 在骨代谢和质量中起到重要的作用。植物相关成分对骨质疏松症具有潜在的影响[40]，并且使得SIRT1 也增加了增殖和分化。当前研究表明，SIRT1表达的减少，可增加啮齿动物中的BMD[41]。在目前的实验方案中，OVX 组大鼠SIRT1基因的表达显著上升，经过HP 及AN 治疗后显著降低。故间接的反映了橙皮苷的抗骨质疏松作用。

在当前对HP 的相关研究中，在HP 通过抗炎和抗氧化作用在绝经后骨质疏松症这一领域研究相对较少，相反，研究其他的作用机制相对较多。但此前大量文献表明橙皮苷具有抗炎及抗氧化的作用[13-15]，而炎症反应及氧化应激是PO 的主要发病机制之一[2,5,12]，通过此次实验研究发现，HP 可呈浓度依赖性的方式通过维持Ca2+和P5+水平的平衡、降低促炎细胞因子、增强抗氧化能力、降低骨周转换物质水平、增强BMD和降低SIRT1 基因的表达来在OVX 诱导形成的骨质疏松症大鼠中发挥抗骨质疏松作用；表明橙皮苷可通过抗炎及抗氧化作用机制在一定程度上预防或治疗绝经后骨质疏松症。

但本实验仍有不足之处，OVX 大鼠的研究模型有一定的局限性且未涉及细胞实验，因此需要进一步的细胞研究或其他体外研究验证其作用机制。同时，HP的浓度选取是否覆盖橙皮苷对OVX 大鼠的各项生化指标、骨生物力学及基因的影响浓度峰值尚不可知，需要更多的体外研究验证HP 其浓度依赖性。总之，HP 可以作为治疗绝经后骨质疏松症的潜在药物，但具体治疗效果需进一步进行相关实验甚至临床相关研究。