响应面优化超临界CO2萃取两粤黄檀挥发油的工艺研究及成分分析

田歌 刘双

摘要：两粤黄檀作为一种名贵的香料，提高其挥发油的萃取率对工业生产具有重大意义。以两粤黄檀为原料，采用超临界CO2萃取两粤黄檀挥发油，在单因素试验的基础上，利用响应面优化萃取工艺，并确定了最佳工艺条件，利用气相色谱-离子迁移谱对两粤黄檀挥发油的挥发性成分进行分析。研究表明，两粤黄檀挥发油最佳萃取工艺为萃取压力30 MPa、萃取温度42 ℃、萃取时间3.8 h，在此条件下挥发油得率为（7.23±0.03）%，与理论值（7.44±0.05）%相差不大。从两粤黄檀挥发油中共鉴定出47种已知化合物，包含醛类17种、酮类3种、醇类5种、酯类11种、萜烯类7种、酸类2种、呋喃类1种、硫醚类1种，醛类、酯类和萜烯类是两粤黄檀挥发油的主要挥发性成分。该研究对两粤黄檀挥发油的进一步开发利用有重要意义。

关键词：两粤黄檀；挥发油；超临界CO2萃取；响应面法

中图分类号：TS224.4      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）02-0152-05

Optimization of Supercritical CO2 Extraction Process of Volatile Oil from Dalbergia benthamii by Response Surface Methodology and Its Component Analysis

Abstract： Dalbergia benthamii is a precious spice. Improving the extraction rate of its volatile oil is of great significance for industrial production. With Dalbergia benthamii as the raw material， supercritical CO2 extraction method is used to extract volatile oil from Dalbergia benthamii. Based on single factor test， response surface methodology is used to optimize the extraction process， and the optimal process conditions are determined. The volatile components of Dalbergia benthamii volatile oil are analyzed by gas chromatography-ion migration spectrometry. The results show that the optimal extraction process of volatile oil from Dalbergia benthamii is as follows：extraction pressure is 30 MPa， extraction temperature is 42 ℃ and extraction time is 3.8 h. The yield of volatile oil under these conditions is （7.23±0.03）%， which is close to the theoretical value of （7.44±0.05）%. A total of 47 known compounds are identified from volatile oil of Dalbergia benthamii， including 17 aldehydes， 3 ketones， 5 alcohols， 11 esters， 7 terpenes， 2 acids， 1 furan and 1 thioether. Aldehydes， esters and terpenes are the main volatile compounds in Dalbergia benthamii volatile oil. This study is of great significance for the further development and utilization of volatile oil from Dalbergia benthamii.

Key words： Dalbergia benthamii; volatile oil; supercritical CO2 extraction; response surface methodology

兩粤黄檀（Dalbergia benthamii）[1-2]是豆科蝶形花亚科黄檀属植物，生于疏林或灌丛中，常攀援于树上，主产于我国广东、海南、广西、云南等地及缅甸、印度尼西亚等地，因其产地少、多年成材，故非常名贵。由于其具有留香持久和挥发缓慢的特性，两粤黄檀自古以来被用作名贵商用香料的原材料[3]，其木心的提取物也用于香精香料的调配[4]；同时其也是名贵的中药材，古战场上用于刀伤止血，《中国植物志》记载其“全株可药用，治风湿、跌打、扭挫伤，有消肿止痛之效”[5]，还具有治疗心血管病、糖尿病、急性肠胃炎、抗氧化、抗菌、抗炎等多种功效及生物活性[6]。

目前对植物心材挥发油的提取方法主要有传统提取方法如水蒸气蒸馏法[4]、溶剂萃取法、压榨法[7]和新型提取方法如超声波辅助提取法、固相微萃取法、离子液体提取法、超临界萃取法和亚临界萃取法等[8-10]。作为名贵的香料，提高其挥发油的萃取率对工业生产具有重大意义。提升两粤黄檀挥发油的萃取率应从两个方面着手：一是要选取高效率的提取方法；二是通过工艺优化来提升提取率。Hui等[11]在比较超临界CO2萃取与有机溶剂萃取法提取地钱科植物挥发油时发现，超临界CO2萃取可以更好地保留有效成分，减少有机溶剂的残留。宋欢等[12]发现，超临界CO2萃取比水蒸气蒸馏法的提取率更高，挥发油的有效成分更多。杨君等[13]综述得出，超临界CO2萃取具有可室温操作、提取原料中大部分有效成分、减少残留、提取率高等优点，可见超临界CO2萃取法在挥发油提取中的应用有一定优势。

近年来，对于黄檀属植物挥发油及功能性成分的研究主要集中于降香黄檀、斜叶黄檀，关于两粤黄檀的相关研究文献极少，仅梁天坚等[6]采用乙醇提取两粤黄檀，其焦点在于两粤黄檀提取物的功能性成分分析，并研究了抗炎活性。卢澄生等[2]采用超临界CO2萃取不同产地两粤黄檀挥发油并进行了成分分析，未对超临界CO2提取工艺进行深入研究。2018年张苏慧等对斜叶黄檀的超临界CO2提取工艺进行了研究，但是工艺优化后精油提取率最高仅达到4.757 3%[14]。本研究对黄檀属植物两粤黄檀挥发油的超临界CO2萃取工艺进行深入研究，得到两粤黄檀挥发油的最佳提取工艺，并采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）联用技术对其挥发油成分进行分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

两粤黄檀：由海南景和农业开发有限公司提供，置于烘箱中恒温烘干（40 ℃）至恒重，粉碎后过40目筛备用；高纯二氧化碳（纯度99.999%）：太原市泰能气体有限公司。

1.2 试验仪器

超临界CO2萃取装置 江苏温奥机械设备有限公司；FlavourSpec 气相色谱-离子迁移谱联用仪 德国 G.A.S 公司；五谷杂粮中药材打碎机 温岭市奥力中药机械有限公司；DHG-9023A型臺式电热恒温鼓风干燥箱 上海垒固仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 两粤黄檀挥发油提取及提取率计算

称取40 g左右粉末样品，用医用纱布包裹两层，用棉线封口后置于萃取釜中。设定所需萃取温度、萃取压力，待萃取压力与萃取温度稳定达到设定值后计时，开始对物料进行超临界CO2萃取，萃取结束后收集挥发油，计算提取率。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 萃取压力对两粤黄檀挥发油提取率的影响

采用萃取温度为45 ℃，萃取压力分别为20，25，30，35，40 MPa，萃取2 h，计算不同萃取压力条件下的萃取率，探索最佳的萃取压力。

1.3.2.2 萃取温度对两粤黄檀挥发油提取率的影响

采用萃取压力为30 MPa，萃取温度分别为30，35，40，45，50 ℃，萃取2 h，计算不同萃取温度条件下的萃取率，探索最佳的萃取温度。

1.3.2.3 萃取时间对两粤黄檀挥发油提取率的影响

采用萃取温度为45 ℃，萃取时间分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h，萃取压力为30 MPa，计算不同萃取时间条件下的萃取率，探索最佳萃取时间。

1.3.3 响应面优化试验

根据单因素试验数据，以两粤黄檀挥发油萃取率（Y）为响应值，采用Design-Expert V8.0.6.1软件设计Box-Behnken试验方案，选取萃取压力（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）为自变量，采用三因素三水平响应面分析方法进行试验分析，因素水平见表1，以此对两粤黄檀挥发油萃取工艺进行优化。

1.3.4 两粤黄檀挥发油成分分析

取两粤黄檀挥发油10 mL置于20 mL顶空瓶中，90 ℃孵育20 min后进样。

气相色谱-离子迁移谱条件：美国Restek公司Wax色谱柱，柱长30 m，内径0.53 mm，膜厚1 μm，柱温60 ℃，载气/漂移气为N2，进样体积100 μL，孵育时间20 min，孵育温度90 ℃，进样针温度95 ℃，孵化转速500 r/min。

1.4 统计分析

每组试验重复3次取平均值，数据采用平均值±标准偏差以及百分数表示。运用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面分析，气相色谱-离子迁移谱数据采用仪器配套的数据库和人工谱图解析进行定性分析，采用峰面积归一法分析各化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取压力对两粤黄檀挥发油提取率的影响

在萃取温度45 ℃、萃取时间2.0 h的条件下，改变萃取压力后萃取率变化见图1。

由图1可知，萃取压力大于20 MPa时，提取率随着压力的增大而提升；当萃取压力大于30 MPa时，提取率反而降低。萃取压力增大时，溶剂分子运动速度增加，且萃取物在超临界CO2中的溶解度增大，使得提取率不断提高，但当萃取压力增大到一定程度时，CO2密度过大，影响了CO2的传质效率，萃取能力反而降低，同时也增加了设备的成本[15-16]。

2.1.2 萃取温度对两粤黄檀挥发油提取率的影响

在萃取压力30 MPa、萃取时间2.0 h的条件下，改变萃取温度后萃取率变化见图2。

由图2可知，随着萃取温度的升高，萃取率不断提高，当萃取温度达到40 ℃时，随着萃取温度的升高，萃取率开始下降，可以看出萃取温度是萃取率的关键因素之一。萃取温度提高有助于增加CO2的流动性，使挥发油更容易溶出，从而提高萃取率；温度过高时，挥发油在超临界CO2中的溶解度降低，反而降低了提取率[17]。

2.1.3 萃取时间对两粤黄檀挥发油提取率的影响

在萃取压力30 MPa、萃取温度45 ℃的条件下，改变萃取时间后萃取率变化见图3。

由图3可知，萃取时间在1～5 h变化时，提取率先升高，当萃取时间达到3 h后萃取率随着时间的增加变化幅度不大。一般情况下，随着萃取时间的延长，萃取率逐渐提高，待萃取率达到峰值后，再延长萃取时间，萃取率不再增加，反而消耗CO2，使得生产成本提高。

2.2 两粤黄檀挥发油超临界CO2萃取的工艺优化

2.2.1 响应面试验设计

根据单因素试验结果，采用响应面分析法对两粤黄檀挥发油提取工艺参数进行优化，Box-Behnken试验设计及结果见表2。

2.2.2 方差分析及显著性检验

采用Design-Expert V8.0.6.1软件对表2中数据进行多元回归分析，其中两粤黄檀挥发油得率（Y）与萃取压力（A）、萃取温度（B）、萃取时间（C）的拟合方程Y=7.18+1.31A－0.48B+0.46C+0.35AB－0.025AC－0.15BC－2.48A2－0.95B2－0.38C2。

模型方差分析结果见表3。

由表3可知，F值越大，P值越小，表示其对应响值变异性影响越大[18]。本试验构建的响应面回归模型的P<0.01，表明影响极显著；失拟项的P=0.175 0>0.05，影响不显著，说明回归方程与实际拟合度较好，能够用于两粤黄檀挥发油萃取试验的理论预测。由表3方差分析可知，3个单因素对萃取率都有极显著影响，交互项AB的影响显著，AC和BC的影响不显著。

2.2.3 响应面分析

响应曲面图可以表现A、B、C 3个因素两两之间的交互作用对Y值的影响。由三维响应面图中的坡度可以判断显著性，坡面越陡越显著[19]。各因素之间交互作用的三维响应面图见图4～图6。

2.2.4 验证试验

运用Design-Expert V8.0.6.1 软件优化工艺条件，最佳工艺参数为萃取压力28.88 MPa、萃取溫度42.40 ℃、萃取时间3.80 h，此时挥发油提取率达到最高7.44%。考虑到实际提取时的局限性及方便性，各工艺参数四舍五入取整：萃取压力30 MPa，萃取温度42 ℃，萃取时间3.8 h，在此条件下进行两粤黄檀挥发油提取验证试验，重复3次，挥发油平均得率为7.23%，与理论值7.44%基本相符，说明该模型的预测性良好、可靠，能够用于实际操作。

2.3 两粤黄檀挥发油的组成分析

对上述最佳工艺条件下萃取得到的两粤黄檀挥发油进行气相色谱-离子迁移谱分析，得气相色谱-离子迁移谱图，见图7。横坐标代表离子迁移时间，纵坐标代表气相色谱的保留时间，图中每一个点代表一种挥发性有机物，颜色的深浅代表物质的浓度大小，颜色越浅代表浓度越小。

由图7可知，两粤黄檀挥发油挥发性组分能够通过GC-IMS 技术很好地分离，结果显示两粤黄檀挥发油中共分离出105个峰，包括部分化合物的单体及其二聚体，共鉴定出47种化合物。47种化合物中含醛类17种、酮类3种、醇类5种、酯类11种、萜烯类7种、酸类2种、呋喃类1种、硫醚类1种，可以看出醛类、酯类和萜烯类是两粤黄檀挥发油的主要挥发性成分。采用峰面积归一法分析各化合物的相对含量，结果见表4。

由表4可知，采用超临界CO2萃取得到的两粤黄檀挥发油中主要易挥发性成分有己醛、异戊醛、苯甲醛、丁醛、糠醛、丙醛、正戊醛、（Z）-丙酸-3-己烯酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、正丁醇、α-蒎烯、α-异松油烯、β-蒎烯、柠檬烯、二甲基硫醚。α-蒎烯是一种双环单萜分子，具有保护脑组织、减少脑水肿和梗塞范围、改善神经行为的功能，此外，Li等[20]还发现其能够增加抗氧化酶活性，减轻酒精诱导的小鼠肝损伤。柠檬烯是一种天然单萜烯，在抑制微生物生长繁殖、抗炎、抗肿瘤、止咳平喘、缓解抑郁等方面都有作用[21]。此外，α-异松油烯、β-蒎烯等也具有抗炎、抑菌活性[22-23]。α-蒎烯、α-异松油烯、β-蒎烯、莰烯、柠檬烯和其中的一些酯类、醛类都能够赋予两粤黄檀挥发油草香、药香、木香等气味。此研究结果对明确两粤黄檀挥发油易挥发性成分的构成及含量，以及对两粤黄檀挥发油的药用价值及保健功能的进一步研究具有重要意义。

3 结论

本研究运用响应面法优化了超临界CO2萃取两粤黄檀挥发油的萃取压力、萃取温度、萃取时间等工艺条件，得到最佳工艺条件为萃取压力28.88 MPa、萃取温度42.40 ℃、萃取时间3.80 h，在此条件下预测挥发油得率为7.44%。考虑到实际提取时的局限性及方便性，经验证，在萃取压力30 MPa、萃取温度42 ℃、萃取时间3.8 h的条件下挥发油得率为7.23%，可以看出采用超临界CO2萃取两粤黄檀挥发油的得率高，对易挥发性功能成分破坏小。采用气相色谱-离子迁移谱对两粤黄檀挥发油易挥发性成分进行分析，共鉴定出47种已知成分，包含醛类17种、酮类3种、醇类5种、酯类11种、萜烯类7种、酸类2种、呋喃类1种、硫醚类1种。其中醛类、酯类、萜烯类化合物占绝对优势，由于两粤黄檀具有草药香、木香等挥发性成分及生物活性成分，故可作为药物和精油的原材料，本研究也为两粤黄檀进一步的开发利用提供了一定的理论基础。

参考文献：

[1]张丹雁，高世军，张雷，等.海南民族习用香药两用降真香的原植物品种鉴定[J].安徽农业科学，2016，44（29）：147-150.

[2]卢澄生，韦建华，陈睿，等.超临界二氧化碳萃取法提取不同产地两粤黄檀的挥发油及其成分分析[J].化工技术与开发，2020，49（7）：56-58.

[3]唐慎微.重修政和经史证类备用本草[M].北京：人民卫生出版社，1957.

[4]刘祥义，李威达，胡翔飞，等.降真香水蒸气蒸馏挥发油的化学组分[J].农技服务，2021，38（2）：59-62.

[5]中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第四十二卷.被子植物门 双子叶植物纲 豆科（二）[M].北京：科学出版社，2006：108-110.

[6]梁天坚，陈睿，刘本涛，等.两粤黄檀乙醇提取物化学成分分析及抗炎活性研究[J].广西植物，2021，41（7）：1035-1045.

[7]马若克.降香黄檀叶提取物主要化学成分研究[D].南宁：广西大学，2018.

[8]OKOH O O， SADIMENKO A P， AFOLAYAN A J， et al. Comparative evaluation of the antibacterial activities of the essential oils of Rosmarinus officinalis L. obtained by hydrodistillation and solvent free microwave extraction methods[J].Food Chemistry，2010，120（1）：308-312.

[9]FARHAT A， BENMOUSSA H， BACHOUAL R， et al. Efficiency of the optimized microwave assisted extractions on the yield， chemical composition and biological activities of Tunisian Rosmarinus officinalis L. essential oil[J].Food and Bioproducts Processing，2017，105（9）：224-233.

[10]MA C H， LIU T T， YANG L， et al. Ionic liquid-based microwave-assisted extraction of essential oil and biphenyl cyclooctene lignans from Schisandra chinensis Bail fruits[J].Journal of Chromatography，2011，1218（48）：8573-8580.

[11]HUI C， JIAN B X， MING X， et al. Comparison of volatile components of Marchantia convoluta obtained by supercritical carbon dioxide extraction and petrol ether extraction[J].Journal of Food Composition and Analysis，2007，20（1）：45-51.

[12]宋欢，韩燕，万佳.超临界CO2萃取与水蒸气蒸馏法提取珊瑚姜挥发油的比较[J].食品工业，2014（3）：214-216.

[13]杨君，张献忠，高宏建，等.天然植物精油提取方法研究进展[J].中国食物与营养，2012，18（9）：31-35.

[14]张苏慧，廖良坤，魏晓奕，等.超临界CO2萃取斜叶黄檀精油工艺优化及精油成分分析[J].热带作物学报，2018，39（4）：174-179.

[15]李响，王卫飞，周瑢，等.超临界二氧化碳萃取沉香精油的工艺优化[J].食品工业科技，2014，35（20）：280-283.

[16]王东营，陈鑫沛，孟雨东，等.响应面法优化超临界CO2萃取芫荽精油的工艺研究[J].粮食与油脂，2022，35（10）：64-67.

[17]王昌涛，张萍，董银卯.超临界CO2提取牡丹籽油的工艺以及成分分析[J].中国粮油学报，2009，24（8）：96-99.

[18]LI Q， FU C. Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein[J].Food Chemistry，2005，92（4）：701-706.

[19]谢志新，陈琳琳，张文州，等.八角茴香挥发油超声辅助提取及抗氧化性研究[J].中国调味品，2018，43（4）：124-128.

[20]LI Y S， HUANG H Q， FENG S B， et al. The alleviated effect of α-pinene on amidst alcoholic liver injury pathology through autophagy activation in mice[J].Journal of Nutrition and Food Processing，2023，6（1）：1-12.

[21]劉洋，吉燕华，雒珂昕，等.柠檬烯应用的研究现状[J].中药药理与临床，2021，37（5）：244-248.

[22]吴华，戴建青，陈大嵩，等.三种植物精油对草菇害虫双额岩小粪蝇的熏杀击倒及其混配增效作用[J].食用菌学报，2019，26（4）：137-142.

[23]张美红，王萌，杨书珍，等.β-蒎烯抑制柑橘意大利青霉作用机制初步研究[J].华中农业大学学报，2018，37（6）：91-97.