周晓 刘倩倩 伍灵芝 蒋立文 黄海 刘洋
摘要:螺蛳粉汤料包味道鲜美,但原料利用率低,螺肉固有的腥味严重影响其应用前景。文章以新鲜石螺肉为原料,通过氮回收率和水解度评价炒制对螺肉蛋白利用的影响,并结合顶空固相微萃取-气质联用技术(HS-SPME-GC-MS)探究美拉德反应对炒制/未炒制的石螺肉挥发性成分的影响。结果显示,未炒制的石螺肉水解度低于炒制组,但其蛋白质回收率远高于炒制组,达67.60%。GC-MS共检测出154种挥发性化合物,炒制后样品中挥发性物质较新鲜样品减少,酶解组样品中数量也出现明显减少。而美拉德反应后,形成了苯乙醛、2-乙基呋喃等香气成分,具有不良气味的壬醛、3-庚酮等物质的相对含量降低,且新鲜组去腥效果更明显。上述结果为石螺肉酶解产物脱腥工艺及石螺呈味基料的制备提供了理论基础。
关键词:石螺肉;酶解;腥味;美拉德反应;挥发性化合物
中图分类号:TS201.1 文献标志碼:A 文章编号:1000-9973(2024)02-0137-10
Effect of Different Processes on Flavor Substances of Enzymatic Hydrolysates of Pond Snail Meat
Abstract: The soup package of river snails rice noodles is delicious, but the utilization rate of raw materials is low. The inherent fishy smell of snail meat seriously affects its application prospects. In this paper, with fresh pond snail meat as the raw material, the effect of frying on the protein utilization of snail meat is evaluated by nitrogen recovery rate and hydrolysis degree, and the effect of Maillard reaction on the volatile components of fried or unfried pond snail meat is investigated using headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). The results show that the hydrolysis degree of the unfried pond snail meat is lower than that of the fried group, but its protein recovery rate is much higher than that of the fried group, reaching 67.60%. A total of 154 volatile compounds are detected by GC-MS. After frying, the volatile substances in the sample decrease compared to the fresh sample, and the quantity in the enzymatic hydrolysis group sample also significantly decreases. After Maillard reaction, the aromatic components such as phenylacetaldehyde and 2-ethylfuran are formed. The relative content of substances with adverse odors such as nonanal and 3-heptanone decreases, and the deodorization effect of the fresh group is more obvious. The above results have provided a theoretical basis for the deodorization process of enzymatic hydrolysates of pond snail meat and the preparation of pond snail flavor basic materials.
Key words: pond snail meat; enzymatic hydrolysis; fishy smell; Maillard reaction; volatile compounds
螺是典型的高水分、高蛋白、低脂肪的淡水贝类动物,属于软体动物门[1]。国内产地集中在山东、河北、辽宁、广西等地,螺种类繁多,可食用螺主要包括石螺、香螺、泥螺、东风螺等。石螺肉不仅味道鲜美,口感独特,而且体内氨基酸含量和分布比较均衡,包括天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸等,含有维生素E和微量元素[2],被广泛用于螺蛳粉和肉酱等产品中。
螺蛳粉是广西柳州的特色美食,具有当地特有的口感,在软韧的米粉基础上,辅以酸笋、花生、油炸腐竹等,用浓而不腻的酸辣味螺肉汤调和而成[3]。螺蛳粉汤离不开石螺,但现有的熬煮工艺原料利用率低、成本高,且螺肉固有的腥味影响了消费者的可接受程度。利用生物酶解制备石螺肉呈味基料反应条件温和、水解效率高,但腥味明显,严重影响其应用前景[4]。通常美拉德反应可通过产生吡嗪类、吡啶类等一系列香味物质来掩盖产品的不良气味。高加龙等[5]实验证明美拉德反应后牡蛎酶解产物的腥味得到了较大的改善。步营等[6]以实现蓝蛤酶解液的风味修饰为目的,对美拉德反应进行工艺优化,最终得到了无腥味、整体协调性好且肉香味浓郁的反应产物。
本实验利用蛋白酶解技术和美拉德反应,并通过HS-SPME-GC-MS分析,研究比较了经炒制、酶解和美拉德反应后石螺肉的氮回收率、水解度和挥发性物质的变化情况,探究了美拉德反应对石螺肉的脱腥效果,以期为石螺肉产品的进一步开发利用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
石螺肉:市购,放入-20 ℃低温冰箱中冷冻保藏。氢氧化钠、硼酸、盐酸、葡萄糖、磺基水杨酸、茚三酮、NaCl、十二烷基硫酸钠、硼砂(均为AR):国药集团化学试剂(上海)有限公司;2-甲基-3-庚酮、邻苯二甲醛、1,4-二疏基苏糖醇、丝氨酸(均为色谱纯):Sigma-Aldrich公司;木瓜蛋白酶、风味蛋白酶(500 IU/mg):比利时Enzybel公司。
1.2 仪器与设备
萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDM)、萃取瓶 美国Supelco公司;7890B-5977A GC-MS气相色谱-质谱联用仪 安捷伦科技有限公司;AUY220分析天平 日本岛津公司;DW-HL218型超低温冷冻储存箱 中科美菱低温科技股份有限公司;SHZ-82B水浴恒温振荡器 常州金南仪器制造有限公司;ReadMax 1900光吸收型全波长酶标仪 上海闪谱生物科技有限公司;KDN-19Y 凯氏定氮仪 上海纤检仪器有限公司;SB-5200DT 超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备
石螺肉酶解液:分别取新鲜石螺肉和已炒制过的石螺肉50 g,按料液比1∶1(g/mL)加水50 mL,根据预实验优化的最佳酶解条件为木瓜蛋白酶0.03 g,风味蛋白酶0.03 g,调节 pH至7.0左右,在55 ℃下恒温水浴酶解5 h。冷却后离心(8 000 r/min,20 min),取上清液,加入0.2 g葡萄糖,用保鲜膜封口,于100 ℃条件下热反应1 h。
1.3.2 蛋白質含量的测定
参照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》进行测定。石螺肉蛋白质换算系数为6.25。酶解产物蛋白质回收率计算公式如下:
1.3.3 水解度(DH)的测定
石螺肉酶解液中的游离氨基酸态氮含量依据甲醛电位滴定法进行测定,计算公式如下:
1.3.4 挥发性风味物质的测定
参照周晓等[7]的方法进行测定。
1.4 数据分析与处理
利用Origin 2021对数据进行绘图分析;采用NIST 20质谱数据库对各色谱峰进行定性分析,筛除匹配度小于80%的物质,选择匹配度最高的物质作为定性结果。 通过CAS号在http://search.ichemistry.cn/网站上查询中英文名称,并使用面积归一化法计算各成分的相对百分含量。
2 结果与分析
2.1 热处理对石螺肉酶解液中蛋白质回收率和水解度的影响
炒制以油作为加热介质,通常烹饪温度较高,由图1可知,新鲜组(X)的氮回收率(67.60%)远高于炒制组(C:24.91%)。可能与炒制时温度较高引起蛋白质变性,造成蛋白质损失有关,潘冬梅等测定了炒制后的猪肝中的营养损失,发现蛋白质从22.1 g/100 g降低至2.1 g/100 g[8]。此外,石螺肉炒制后水分丧失,导致水的有效浓度降低,整个反应体系偏黏稠,不利于热处理时蛋白质的充分溶出,同时也使蛋白酶与底物蛋白酶切位点碰撞的几率变小,最终造成蛋白质回收率下降[9]。此外,炒制后的石螺肉表面疏水性增加,部分蛋白质发生了交联及氧化修饰,出现蛋白质的聚集,产生了抵抗酶切的密集结构和氧化型氨基酸残基,导致这部分蛋白质序列不能够被有效水解[10],可能造成炒制后石螺肉蛋白质回收率下降。水解度通常被用作蛋白质水解程度的评价指标。样品C2的水解度明显高于新鲜石螺肉酶解样品(X2),提升了6.85倍,这可能是炒制后的石螺肉蛋白质变性结构发生变化,酶切位点被隐藏,难以被水解,而溶于水中的蛋白、肽类被蛋白酶反复降解所导致的,与李小锋等[11]针对多宝鱼不同水解物肽段的研究结果相似。
2.2 美拉德反应对石螺肉酶解液风味物质的影响
2.2.1 GC-MS离子流图分析
HS-SPME-GC-MS具有检出限低、灵敏度高、分析速度快等优点,其中GC(气相色谱)主要起分离作用,MS(质谱)发挥检测作用[12]。从总离子色谱图中可以直观地看出不同热处理后石螺肉中各物质峰的变化情况。由图2可知,C1和X1样品峰形状较相似,说明炒制对螺肉挥发性成分的影响有限。而酶解及美拉德反应后,15 min后的色谱峰明显增加,表明产生了一些极性较弱的挥发性成分。特别是X3样品在30~35 min处出现了响应值超过5.0×106 mV的色谱峰,说明新鲜螺肉酶解产物在美拉德反应后生成了较多新的挥发性成分。董烨等[13]、柯志刚等[14]也有类似的发现。
2.2.2 不同样品中挥发性物质种类分析
由图3可知,样品炒制后(C1)较新鲜样品仅有1种物质差异,说明炒制对螺肉挥发性成分种类的影响较小,而经过酶解后,C2及X2分别增加了7~10种新的物质,说明酶解会促使新的风味物质形成。美拉德反应后,C3和X3中特有的挥发性物质分别达到27种和32种,说明美拉德反应导致形成了新的化合物,如具有坚果香味的2,5-二甲基吡嗪和具有鱼肉香的2-正戊基呋喃、2-正丙基呋喃等,与董烨等[13]的研究结果一致。此外,与炒制螺肉酶解产物(C2)相比,未炒制的螺肉酶解产物(X2)经过美拉德反应后的挥发性物质种类增加更明显(15种),说明未炒制的螺肉的美拉德反应更剧烈,这可能与其较高的蛋白浓度有关。
进一步分析可知,6种样品中共有的化合物仅10种(见图3),以醛类和酮类物质为主,包括苯甲醛、反-2-辛醛、壬醛、3-庚酮、4-辛酮和甲基庚烯酮等。其中苯甲醛、壬醛和3-庚酮已被证实是水产品中重要的腥味物质[15],推测这些物质可能是石螺肉腥味的主要来源,且炒制和美拉德反应均不能完全除去石螺肉中的腥味。
2.2.3 不同样品中挥发性物质组成分析
挥发性化合物的组成和含量在一定程度上决定了样品的风味特征。在不同热处理后的石螺肉中共鉴定出154种挥发性化合物,其中炒制后C1样品较新鲜,样品挥发性物质减少了2种,分别为二氢猕猴桃内酯和2-甲基-4-庚酮。酶解后,X2和C2样品中挥发性物质数量明显减少,相较于酶解前,分别减少了8种和5种,主要为醛类物质,包括具有鱼腥味的癸醛、具有辛辣味的丙醛等物质,说明酶解起到一定的脱腥效果。而美拉德反应后,X3和C3样品中分别检测出75种和58种物质,相较于酶解后的样品出现了增加,且新鲜组增加更明显。有研究表明,美拉德反应后挥发性物质种类增加,其反应产物的新增丰富了肉制品的香味,掩盖了不良气味,从而达到脱腥的效果[16]。
由图4中B可知,不同样品检出的风味物质的含量占比差异明显,醛类、醇类和酮类化合物是6种样品中的主要化合物。在6个样品中,醇类、烃类和酸类物质均呈先减少后增加的趋势,其中醛类物质为所有样品中的主要挥发性化合物,相对含量变化明显。炒制后石螺肉C1对比新鲜石螺肉相对含量出现了轻微增加(X1:28.80%;X2:28.88%),说明脂肪酸的氧化随着炒制加工而加剧。酶解后其相对含量出现显著降低,杜慧颖等[17]也有类似的发现。而美拉德反应后新鲜组的醛类物质含量降低至16.22%,相比于X2降低了7.17%,而炒制组石螺肉C3中醛类物质含量降低至21.19%,相较于酶解后C2出现了一定的上升,说明炒制对石螺肉的物质结构产生了一定的影响,导致其酶解反应和美拉德反应效果与新鲜组产生差异。
2.2.4 GC-MS挥发性化合物分析
醛类主要来源于不饱和脂肪酸氧化或氨基酸降解,低级醛具有其自身的气味,如C2~C4醛具有刺激性气味如腥味、辛辣味,而C5~C9醛具有青气、油脂哈喇味和油蜡味,其阈值通常比其他化合物低,因此醛类经常被作为评价肉类及其制品风味的有效指标[18]。在本研究中,醛类是美拉德反应后样品中最主要的挥发性化合物,而其他研究也表明醛类是水产品中最主要的风味物质。壬醛相對含量最高(X1:4.62%;C1:4.64%),具有强烈的鱼腥味和油脂气味[4],酶解后相对含量出现了一定降低。美拉德反应后,相对含量显著下降(X3:1.02%;C3:0.30%)。构成水产品腥味的主要物质(E,E)-2,4-庚二烯醛[19]在X3和C3中也表现出明显降低。除苯甲醛(苦杏仁味)和苯乙醛(花香味)外,其余醛类均在美拉德反应后出现了明显的下降,说明其可能在美拉德反应过程中转化为其他物质,如杂环小分子物质、类黑素物质等。
酮类具有脂肪和坚果的良好风味,但是其相对含量较低并且具有较高的气味阈值,可以起到使产品整体风味更加饱满的辅助作用[20]。6种样品中共检测出22种酮,其中3-庚酮、3-辛烯-2-酮和3,5-辛二烯-2-酮具有土腥味、哈喇味和腐臭味[21-22]。前者在新鲜组呈现持续下降的趋势,美拉德反应后其相对含量降低至0.36%,但在炒制组则表现为先下降后上升的趋势,美拉德反应后相较于酶解后出现了一定的增加(C2:0.67%;C3:0.91%),而后两者在酶解后和美拉德反应后均未检出。这可能是在热反应过程中,酮类作为肉类风味的前体物质参与美拉德反应生成吡嗪、噻唑、吡啶等具有肉味的杂环类化合物[23]。
醇类主要来源于多不饱和脂肪酸的降解或羰基化合物的还原,具有植物芳香味,但由于醇类的感官阈值高,其风味贡献较小[20]。1-辛烯-3-醇,又称“蘑菇醇”,是贝类水产品的特征风味物质,主要表现为土腥味,是花生四烯酸氧化的产物[24],在6种样品中均有检出。X1和C1差异较小,但酶解后均出现增加,X2中增加了8.44%(19.33%),炒制后的样品酶解后仅增加了0.07%(C2:10.99%),可能是由于高温炒制造成脂肪氧化酶活力降低。美拉德反应后,X3和C3中醇类物质相对含量分别降低至6.34%和7.35%,与郭淑等[25]的研究结果类似,表明醇类在热处理过程中容易发生醇类氧化反应及美拉德反应。
吡嗪和呋喃类化合物来源于氨基酸与还原糖的美拉德反应以及氨基酸的热分解反应,它们大都具有很强的肉香味以及极低的香气阈值[26]。美拉德反应后,吡嗪类物质在新鲜组和炒制组均出现了增加,其中具有巧克力味和黄油味[6]的2,5-二甲基吡嗪从未检出增加至0.75%(X3)和0.43%(C3)。呋喃类化合物仅在炒制组C3中检出,包括具有类似火腿香味的2-戊基呋喃和肉香味及焦香味的2-乙基呋喃[27],说明美拉德反应具有较好的改善食品风味的效果。
短链酯类化合物能赋予食品脂肪香、水果香和玫瑰香等,本实验共检出10种酯类,但相对含量均较小。此外,美拉德反应后,酸类和烃类物质的种类和含量都出现了增加,酚类物质相对含量出现了一定程度的降低,但是由于其阈值普遍较高,通常对样品风味的影响较小。同时美拉德反应后还鉴定出一些芳香族化合物,其主要来源于芳香族氨基酸的分解代谢。而在石螺肉原料中相对含量较高的对甲基苯酚(X1:3.28%;C1:3.29%)具有窖泥臭味和皮革味[28],在美拉德反应后均未检出。
2.2.5 GC-MS检测后腥味物质比较
底物经过酶解后可以起到脱除腥味的效果,但酶解液成分复杂,含有丰富的蛋白质和多肽,酶解后的产物仍存在一定腥味。根据文献[29-30]报道,本实验中共鉴定出引起石螺肉腥味的物质18种,包括醇类2种、醛类10种、酮类4种、酸类1种和其他化合物1种。乙酸是美拉德反应中脱羧时的副产物,因此随着反应的进行,相对含量出现增加,但由于其阈值较高,因此对风味的贡献并不十分明显[31]。除乙酸外,其余17种物质的相对含量均在美拉德反应后减少,其中壬醛减少最明显,新鲜组从4.62%降低至1.02%,炒制组从4.64%降低至0.30%,与宁海花等[32]的研究结果一致,这可能是由于较高的热反应温度加速了壬醛与氨基酸发生美拉德反应或者转化成羧酸等其他挥发性物质,从而导致其相对含量降低。从整体来看,X1(23.37%)和C1(23.43%)的腥味物质含量差异较小,且美拉德反应后,新鲜组的腥味物质总相对含量降低明显(X3:7.63%<C3:10.92%),说明炒制后的石螺肉去腥效果较差。研究表明,蛋白质可以通过各种相互作用力,如非共价键合、共价键合和传质效应等来影响食品中香气化合物的保留与释放,也可以通过物理截留方式来抑制香气化合物的动态变化,而高温炒制可能破坏了蛋白质的结构,从而导致炒制组的去腥效果相对较差[33]。
3 結论
本文以新鲜石螺肉为原料,以氮回收率和水解度评价石螺肉蛋白的利用情况,结合HS-SPME-GC-MS比较了不同工艺对石螺肉酶解产物风味物质的变化。结果表明,尽管炒制后石螺肉的水解度明显高于新鲜石螺肉组,但新鲜组的氮回收率(67.60%)远高于炒制组(24.91%),说明炒制会影响螺肉的蛋白质利用率。HS-SPME-GC-MS结果表明,6种样品中共检出154种挥发性化合物,其中醛类、醇类和酮类的相对含量较高。炒制后的样品较未炒制的样品挥发性物质减少2种,分别为二氢猕猴桃内酯和2-甲基-4-庚酮。酶解后,X2和C2样品中挥发性物质特别是醛类物质也明显减少。而美拉德反应后,醛类、醇类和酯类物质总相对含量均出现明显降低,其中具有苦杏仁味的苯甲醛、花香味的苯乙醛、肉香味及焦香味的2-乙基呋喃和巧克力味的2,5-二甲基吡嗪等物质相对含量升高。此外,1-辛烯-3-醇、丙醛、壬醛等17种具有腥味或油脂哈喇味的物质相对含量均出现一定程度的下降,且新鲜组的去腥效果相较于炒制组更明显。综上,炒制不仅不能起到去腥的作用,而且会影响石螺肉蛋白质的利用及后续美拉德反应对石螺肉风味的改善效果。本研究为石螺呈味基料的制备工艺优化及规模化应用提供了理论支持。
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