鸡精液稀释液的筛选

柳嘉毅 刘启红 彭先 杨慧 邱美珍 曾一鸣 燕海峰

摘 要：为筛选出效果较好的B系列鸡精液稀释液，以稀释后冷藏保存不同时长精子活力、受精率与孵化率为检测指标进行研究，结果表明：1）稀释冷藏30 min 后，EL、EH组的精子活力显著优于B1组（P<0.05）；冷藏24 h后，EH、EL组的精子活力显著高于P组（P＜0.05）；B1组和P组在各时间点均无显著性差异；2）稀释后立即输精，EL组的受精率比B1组高4.9%，但受精蛋孵化率降低5.5%，最终B1组入孵蛋孵化率比EL组高0.7%；稀释冷藏10 h后输精，EL组受精率比B1组高7%，但受精蛋孵化率比B1组低11%。B1组入孵蛋孵化率比EL组高5%，但比原精组低3%；3）稀释湘黄鸡精液冷藏运输70 km后输精，6个家系平均受精率为83.7%，受精蛋孵化率为89.8%，入孵蛋孵化率为75.2%；4）稀释液实际应用方面：B1、B2液输精效果较好，但B2液成本较低，孵化结果优于B1液与鸡场自配稀释液。综上所述，单纯降低B系列稀释液中TES含量（B1液）不利于精子生存，而等比例降低各组分，将渗透压调整为280 mOsm/kg（B2液）时，孵化效果较好。

关键词：鸡精液稀释液；精子活力；受精率；孵化率

公鸡精液具有体积小、精子密度大、体外存活时间短等特点[1]。采集的原精如果30 min内不输精，精子便会凝结、死亡[2]。鸡精液稀释液是通过模拟鸡精液成分配制出适宜精子生存并保持其良好受精能力的液体。鸡精液稀释技术在鸡人工授精中有较大的应用价值，一是可以大幅度提高公鸡配种的母鸡数，减少种公鸡的饲养量，降低鸡场运营成本；二是能降低精子密度，改善精子体外生存环境，延长精子体外存活时间，从而延长输精时间[3-4]；三是如果稀释冷藏一定时间后输精效果与原精无显著差异，那么就能实现公鸡与母鸡分开饲养，集中采精、输精，实现更科学的种鸡管理[5]。然而，鸡精液稀释液的效果差异較大，受到温度、渗透压、稀释液配方等因素影响。因此，通过对稀释与冷藏后精子活力、输精后受精率、受精蛋孵化率以及异地输精效果等指标进行检测，筛选出效果较好的鸡精液稀释液，为研发高效稀释液及配套技术提供数据支撑。

1  材料与方法

1.1  精液稀释液

B系列稀释液配方见表1。与B1稀释液相比，B2稀释液各组分等比例降低，B3稀释液TES含量降低，EH、EL稀释液配方见文献[5]，为湖南省畜牧兽医研究所（简称“畜牧所”）配制；J稀释液为0.9%生理盐水（湖南科伦制药有限公司），简称“盐水”；P稀释液为西班牙Pedro García Casado博士赠送；D稀释液为上海家禽育种有限公司（简称“上海家禽”）种鸡场自配。

1.2  试验动物

种鸡为9月龄，其中湘黄公鸡20只、罗曼母鸡38只，于湖南省畜牧兽医研究所单笼饲养；湘东公鸡90只、母鸡900只，于浏阳市湘依园生态农业有限公司（简称“湘依园公司”）单笼饲养。

1.3  试验方法

1.3.1  精子活力检测  提前在EP管各分装0.6 mL稀释液（P、B1、EH、EL液），采集湘黄公鸡混精2.0 mL，在室温下每管添加0.3 mL精液混匀，于5 ℃冷藏保存。分别于30 min、24 h和48 h后进行精子活力检测，每个时间段检测3次[6]。

1.3.2  立即输精与冷藏输精效果检测   1）稀释后立即输精检测：将罗曼蛋鸡分为两组，每组19只，利用上述优选的B1、EL稀释液，按体积比1：1稀释湘黄鸡混合精液，每只母鸡输精30 μL，每天输精1次，连续2 d。第1次输精24 h后开始捡蛋，连续捡蛋5 d后进行恒温恒湿孵化（37.5 ℃、65%相对湿度）。在孵化至第7天时检测种蛋受精率，孵化至第27～29天时检测孵化率；2）稀释冷藏10 h输精检测：立即输精试验结束20 d后，稀释冷藏10 h后进行输精，以原精组（鲜精输精）为对照，每只母鸡输精体积相同，操作方法与检测指标同上；3）稀释冷藏后远距离运输输精检测：采用B1稀释液等体积比稀释湘黄公鸡精液后，冷藏运输至70 km以外的湘依园公司对湘黄母鸡进行输精（冷藏约5 h，每只母鸡输精体积为30 μL），对照组母鸡为2个家系，采用湘东公鸡鲜精，稀释组母鸡为6个家系，两组输精体积相同，操作方法与检测指标同上。

1.3.3  B系列稀释液渗透压与TES用量优化  采用B1、B2、B3稀释液与常用生理盐水（J液）比较。在湖南湘依园公司，对湘东公鸡精液等体积比稀释后立即输精，对照组为原精组，试验组分别为B1、B2、B3组，每只母鸡每次输精25 μL，每天输精1次，连续2 d，第1次输精24 h后开始捡蛋（连续5 d）入孵，测定孵化率。

1.3.4  B系列稀释液实际应用效果检测  1）小规模输精效果检测：将B1、B2稀释液与种鸡场自配稀释液进行小规模输精效果对比试验。采用4种稀释液（B1、B2、种鸡场自配D稀释液和J液）对28羽贵妃公鸡精液进行等体积比稀释，然后对48羽洛岛红母鸡进行输精，每只洛岛红母鸡输精25 μL，检测孵化效果；2）扩大规模输精效果检测：选择B2稀释液和种鸡场自配D稀释液，在河南某种鸡场选择条件相当的1、5号鸡舍，每组采集48羽贵妃公鸡精液进行稀释，分别对732羽洛岛红母鸡进行输精，每只母鸡每次输精25 μL，检测孵化效果。

1.4  统计分析

数据采用SPSS 19.0统计软件中ANOVA程序进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2  结果

2.1  不同稀释液对精子存活力的影响

表2为4种鸡精液稀释液对精子存活力的影响。由表2可知，稀释冷藏保存30 min后，EH、EL组精子存活力显著优于 B1组（P＜0.05）；保存24 h后，EH、EL组保存效果显著优于P组（P＜0.05）；保存48 h后，4种稀释液之间无显著差异（P＞0.05）。

2.2  输精效果对比

2.2.1  稀释后立即输精效果对比  表3为B1、EL稀释精液后立即输精的孵化效果。由表3可知，稀释后立即输精，EL组受精率比B1组高4.9%，但受精蛋孵化率降低5.5%，最终B1组入孵蛋孵化率比E组高0.7%。说明不同稀释液稀释精液后立即输精，受精率与受精蛋孵化率的变化趋势并不一致。

2.2.2  稀释冷藏10 h后输精效果对比  表4为B1、EL稀释精液冷藏10 h后输精的孵化效果。由表4可知，EL組受精率比B1组高6.9%，但受精蛋孵化率却降低10.7%，最终B1组入孵蛋孵化率比EL组高5.0%，但仍比原精组低3.0%。

2.2.3  稀释精液冷藏后远距离运输输精效果  表5为B1稀释精液远距离冷藏运输的输精效果。由表5可知，湘黄鸡精液经B1稀释液稀释冷藏运输70 km后对6家系母鸡输精，受精率在79.0%～90.0%，受精蛋孵化率在86.8%～92.1%，平均受精率83.7%，平均受精蛋孵化率为89.8%，平均入孵蛋孵化率为75.2%。而湘东鸡原精的受精率在91.5%～93.6%，受精蛋孵化率在94.4%～95.3%，平均受精率为92.6%，受精蛋孵化率为94.8%，入孵蛋孵化率为87.8%，均高于B1组。但是，原精组所用公鸡与B1组不同，可能会对试验结果有一定影响。

2.3  B系列稀释液渗透压与TES用量优化

表6为不同稀释液稀释不同家系湘东鸡精液后的输精效果。由表6可知，5组受精率由大到小依次为B2（87.5%）＞J（86.7%）＞原精（86.6%）＞B1（86.5%）＞B3（82.0%）；5组受精蛋孵化率由大到小依次为原精（93%）＞B1（92.2%）＞B2（91.3%）＞J（86.3%）＞B3（85.6%）；5组入孵蛋孵化率由大到小依次为原精（80.5%）＞B2（80.1%）＞B1（78.8%）＞J（73.7%）＞B3（70.0%）；4个稀释液组之间，受精率、受精蛋孵化率均没有显著差异（P＞0.05）。

2.4  B系列稀释液实际应用效果

2.4.1  B稀释液小规模应用效果检测  表7为B1、B2稀释液小规模应用效果。由表7可见，B1组精子活力优于D组，受精率比D组高4%。尽管B2组受精率比J组低4%，但无论是精子活力还是活胚率，B2组要优于J组，尤其是活胚率提高26%。

3  讨论

3.1  鸡精液稀释液筛选

鸡精液稀释液的主要成分有供能的糖类（葡萄糖、果糖等）、维持渗透压的谷氨酸钠、pH缓冲剂（柠檬酸钠、TES）、广谱杀菌物质（鲑鱼精蛋白硫酸盐）等成分。国内外常见的鸡精液稀释液有：BPSE（Beltsville Poultry Semen Extender）、Lake、FEB、Lake and Ravie等[7]。刘红举等[8]比较不同稀释液的效果（Lake、BJJX、BPSE、F.sexton、生理盐水、原精），结果表明受精率由高到低依次为Lakes（93.5%）＞原精（93.0%）＞BPSE（92.9%）＞生理盐水（91.7%），健雏率由高到低依次为Lakes（88.2%）＞BJJX（87.7%）＞BPSE（87.2%）＞生理盐水（86.3%），受精率与健雏率均没有显著差异，但稀释液BPSE、BJJX按体积比2：1与精液稀释，节约了原精使用量。苏东顿[9]等采用STJX（自配稀释液）、BPSE、Lake稀释狄高黄羽肉鸡精液，受精率自高到低分别为Lake（96.0%）＞STJX（95.4%）＞BPSE（91.2%）；稀释冷藏存活时间自高到低分别为STJX（288 h）＞BPSE（252 h）＞Lake（204 h）；稀释冷藏5 h后受精率从高到低分别为STJX（93.3%）＞BPSE（85.9%）＞Lake（80.0%）；稀释冷藏24 h后受精率分别为STJX（82.6%）、Lake（82.5%）。以上结果表明，稀释后立即输精、稀释冷藏不同时间的精子活力、稀释冷藏不同时间后输精的受精率等指标变化趋势均不一致，这与本文结果相同。

徐松山等[10]将北京油鸡混合精液等量分为4个组，Ａ组精液不处理作为对照，Ｂ组用BPSE液按体积比1：1稀释，Ｃ组精液离心去除上层精浆，加入与精浆等体积的BPSE液，Ｄ组在Ｃ组基础上再用BPSE稀释液按体积比1：1稀释，同样发现冷藏不同时间后精子活力、受精率、受精蛋孵化率的变化趋势不一致。Mohan等[11]采用BPSE稀释液稀释地方鸡和白来航鸡精液，立即输精后受精率分别为85%、91%，受精蛋孵化率分别为87%与99%，冷藏24 h后的输精受精率分别为47%与70%，说明不同品种的输精效果差异很大。

近年来在常见稀释液中添加溶质改进效果的研究逐渐增多。Long等[12]报道采用BPSE稀释液时，添加2.5 mg/mL磷脂酰胆碱能显著提高精子的水解能力以及24 h冷藏的火鸡精液的受精率（66%）与孵化率（96.5%）。本课题组一直基于BPSE稀释液在种鸡场应用研究，未来可在该领域进行深入研究。

3.2   鸡精液稀释液渗透压优化

鸡稀释液渗透压是影响受精能力最重要的特性之一[13-14]。有报道认为鸡精液的渗透压一般为330～420 mOsm/kg[15]，也有报道为295～360 mOsm/kg[16]。张兆旺等[17]比较了不同渗透压（304～576 mOsm/L）稀释液对罗斯种公鸡精液精子生存指数与存活时间影响，发现最适宜鸡精子生存的稀释液渗透压为352～362 mOsm/L。赵建军等[18]采用不同渗透压（300、400、500 mOsm/kg）稀释液对罗曼种公鸡精子进行低温保存，发现300 mOsm/kg组精子活力与生成指数最高。稀释液最佳渗透压的范围会受到不同的稀释液种类、添加物质、家禽种类等因素影响，普遍认为稀释液冷藏保存渗透压接近等渗时效果更好。王晓娟等[19]比较了自配YHFB稀释液在低温保存黑凤鸡精液时渗透压（261、294、340 mOsm/kg）的效果，其中261 mOsm/kg组在386 h内精子活力最佳。Moce等[20]研究发现BPSE液最佳渗透压在340～350 mOsm/kg。Woelders等[21]采用Lakes稀释液稀释科布鸡精液在4种不同渗透压下（290、325、365、410 mOsm/kg）冷藏保存4 d，渗透压为290、325 mOsm/kg时精子活率显著高于365、410 mOsm/kg，290 mOsm/kg的膜完整性显著高于其他三组，但低于加入牛血清蛋白后的325 mOsm/kg组。以上研究以稀释冷藏不同时间后精子的存活率为评价指标，未采用输精后受精率与孵化率等指标进行衡量。本试验发现，B2稀释液（287 mOsm/kg）精子活力、受精率与B1液（340 mOsm/kg）没有显著差异，但稍高于B1液，与以上结果相同，揭示出略微低渗的环境更适合体外精子生存。

3.3  B系列稀释液TES用量优化

TES是稀释液中维持pH值的缓冲物质，价格偏高，在保证减少稀释液pH值与渗透压维持在合适的范围前提下，减少其用量对降低稀释液成本至关重要。Lake等[22]研究表明，pH值直接影响鸡精细胞内的酶促反应，进而影响精子的新陈代谢与活力，稀释液pH 在6.8～7.1对精子活力较好。陈理盾等[23]比较了9种不同配方的稀释液对精子存活时间、生存指数的影响，发现最佳配方的pH值为6.7，其他较好的4种配方pH值为6.7～7.2。魏晓冉等[5]报道将低温保存稀释液中TES含量降低时，pH 值由7.16升至7.64，渗透压略微降低，精子活力、受精率、胚早死率均没有显著差异。王晓娟等[19]在研究自配稀释液低温保存黑凤鸡精子效果时，发现稀释液TES浓度降低时，渗透压由340 mOsm/kg降低为261 mOsm/kg，pH值略微变化，TES浓度最低的稀释液精子活力最佳；通过调整稀释液中弱碱盐含量，pH值变化后（pH 7.38、pH 7.29、pH 7.11）对稀释后黑凤鸡精子保存相同时间精子活力差异均不显著。低温保存时，精子对稀释液pH值适应范围较广，原因可能是低温保存的精子新陈代谢微弱。多数稀释液的pH值为弱碱性，因为精液在保存过程中会产生酸性代谢产物，碱性稀释液能够中和一部分酸性物质，防止pH值过低造成精子死亡[24]。

本试验TES用量减半时（B3液），pH值从7.30降低为7.16，渗透压略微降低，尽管精子活力、受精率、孵化率与原精、B1液差异不显著，但受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率远低于原精与B1液，说明单纯降低TES含量，或者TES含量太低，都不利于精子体外生存。将各组分等比例降低（B2液），pH值为7.30，渗透压为287 mOsm/kg，孵化效果与B1液和原精相近。

4  结论

单纯降低B系列稀释液中TES含量（B1液）不利于精子生存，而等比例降低各组分，将渗透压调整为280 mOsm/kg（B2液）时，孵化效果较好。

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