HPLC-MS/MS测定茶叶中灭草松及其代谢物残留量

吴晓萍

福建中检华日食品安全检测有限公司（福州 350028）

茶叶作为一种商品，从其产生发展至今对中国经济及全球贸易的发展起到重要影响作用。世界上存在的3种非酒精类（咖啡、可可和茶叶）饮料中，由于茶叶含有大量多酚、咖啡因和芳香等物质，在抗癌、抗氧化和抗炎等方面具有一定功效，茶叶这一独特的饮品已赢得全球众多人的喜爱，成为世界上最受欢迎的饮料之一[1-2]。

茶叶中存在多种化学物质，在农药残留的检测过程中会对检测结果的准度产生一定的干扰作用，因此在检测前期需要增加对茶叶的前处理净化过程，从而提升检测结果的准确性。有关茶叶的前处理方法主要包括2种，分别为QuEChERS法[3-7]和固相萃取法[8-11]。其中，QuEChERS法具有操作简便、快捷的特点，尤其与液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）结合使用可以大幅提高检测效率。GB 2763.1—2022《食品安全国家标准 食品中2,4-滴丁酸钠盐等112种农药最大残留限量》规定茶叶的灭草松及其代谢物的临时限量为0.1 mg/kg，但尚未指定检测的方法。因此建立一种检测灭草松及其代谢物在茶叶上的残留的方法具有重要意义。

采用QuEChERS的前处理方法净化茶叶，采用LCMS/MS联用的分析方法对茶叶中的灭草松及其代谢物进行定量测定，建立GB 2763.1—2022中灭草松及其代谢物松残留分析方法，可满足茶叶中多农药残留检测的要求，为后续制定灭草松及其代谢物残留分析的标准提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱（1290）-三重四极杆（6475）（美国安捷伦科技有限公司）；低速分离机（德国Sigma公司）；灭草松及代谢产物6-羟基灭草松、8-羟基灭草松（坛墨质检科技股份有限公司）；乙二胺-N-丙基甲硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）及石墨炭黑（GCB）（上海安谱技术有限公司）；柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠（国药集团）；所用溶剂及其他试剂皆为色谱纯；试验用水为3次滤后的纯水。

1.2 标准溶液的制备

标准储备液制备：准确移取1 mL质量浓度为1 000 μg/mL的灭草松及其代谢物于10 mL容量瓶并定容至刻度，得到100 μg/mL的标准储备液，置于-20 ℃冰箱中储存备用。

混合标准溶液制备：准确吸取1 mL标准储备液于10 mL容量瓶，用乙腈定容至刻度线，获得质量浓度10 mg/L混合标准溶液，放于-18 ℃冰箱中存储备用。

1.3 样品的前处理

将茶叶500 g，粉碎后，过0.300 mm（50目）筛，装入8号塑料袋，待用。精确称取2.0 g（精确至0.01 g）茶叶粉于50 mL聚四氟乙烯离心管中，向其中添加5 mL超纯水将其浸泡30 min，添加15 mL的1%（V/V）乙酸乙腈溶液、5 g无水氯化钠、1.5 g醋酸钠，陶瓷均质后在4 000 r/min转速下离心5 min，取其上清液于5 mL离心管（含混合净化剂PSA 50 mg、C18100 mg、GCB 100 mg和MgSO4750 mg）涡漩2 min，置于15 000 r/min的转速下高速离心5 min，过膜后进行上机检测。

1.4 LC-MS/MS仪器条件

色谱条件：色谱柱ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A为4 mmol/L乙酸铵水溶液（0.1%甲酸），流动相B为乙腈；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。质谱条件：多反应监测模式（MRM）、电子喷雾离子源（ESI-）。离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度350 ℃、毛细管电压3.5 kV，喷雾压强35 psi，脱溶剂气流量12 L/min。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

为得到最佳质谱条件，将0.1 μg/mL混标在MS1正负模式下进行扫描得最佳模式下母离子，对每个化合物去簇电压进行优化得到最佳模式，试验结果表明灭草松、6-羟基灭草松和8-羟基灭草松在负模式下响应较大。通过子离子扫描和MRM扫描得到最佳的碎片离子和碰撞能量，具体参数详见表2。

表2 3种农药的保留时间、监测离子对、碰撞能和去簇电压

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂的优化

关于灭草松及其代谢物的提取方式大部分是在酸性条件下，使用丙酮或乙腈进行提取。结果表明，丙酮提取出的样液颜色比乙腈的深，且与水互溶不利于后期的净化。对于液相来说，丙酮不适合直接上机。试验比较纯乙腈或乙酸乙腈两者溶剂对试验结果的影响。如图2所示，含有乙酸的乙腈回收率明显高于乙腈，这跟灭草松属于偏酸性化合物有关，在酸性条件下，使目标物在基质中呈分子态有利于提取。

图1 3种化合物的提取离子色谱图

图2 不同提取剂对3种化合物的回收率的影响

2.2.2 净化剂的选择

茶叶中主要杂质有如色素、生物碱、甾醇和茶多酚、水分及其他干扰物质。茶多酚是主要干扰成分，而叶绿素和叶黄素是茶叶中最直接可见的干扰色素成分。Na2SO4和MgSO4常用于除水剂，Na+的半径相对于Mg2+大，周围可以容纳更多水分子，结合水的数目多，但Mg2+电荷大，半径小，与水的结合能力较强，故无水硫酸镁可作为除水剂。分别优化PSA、C18和GCB的用量，往阴性绿茶样品添加质量浓度20 μg/kg的混标，PSA、GCB和C18的用量为10，50，100，150和200 mg，以3种农药加标回收率评价试验结果。试验结果表明（见图3），随着PSA用量增加，3种农药回收率越来越低，目标物是酸性农药被碱性的PSA吸附严重，其余两者跟目标物无明显吸附，当每毫升加入PSA、C18和GCB的量分别为50，100和100 mg时，3种农药回收率在70%～110%，净化效果最佳。故试验采用50 mg PSA、100 mg C18、100 mg GCB和750 mg MgSO4组合净化剂。

图3 吸附剂组成对提取回收率的影响

2.3 方法评价

2.3.1 方法的线性范围、检出限与定量限

在优化的试验条件下，用茶叶空白样品提取液将3种农药混合储备液进行稀释配得1，5，10，20，40，50和100 μg/L的系列基质匹配标准溶液，根据检测结果绘制标准曲线（横坐标x为32种农药的质量浓度μg/L，纵坐标y为定量离子峰面积），计算3种农药在基质中的检出限（3倍信噪比），以最小添加浓度为定量限。结果显示，3种农药各自线性良好（在基质匹配浓度范围内），相关系数r均大于0.99，灭草松及其代谢物6-羟基灭草松和8-羟基灭草松3种农药的检出限为0.42，0.12和0.014 μg/kg。

2.3.2 基质效应

基质效应在农药分析的过程中普遍存在，用阴性茶叶配制浓度与乙腈配制的标准样液，以二者的响应峰面积的比值计算基质效应的大小。其中，当ME=0.8～1.2时为弱基质效应；反之为中强等基质效应[12]。结果显示，灭草松的值为0.28，6-羟基灭草松为0.21，8-羟基灭草松为0.23，由此判定基质效应较强，采用基质匹配标准曲线进行定量则可减少基质效应带来的结果误差从而提高准确度。

2.3.3 加标回收率与精密度

向空白茶叶基质中添加3个含量水平的混合标准溶液（10，20和100 μg/kg），每个加标水平皆做6次平行试验，优化检测条件后进行测定。测定结果见表3，3种化合物在茶叶中的平均回收率为83.4%～99.2%，相对标准偏差（n=6）区间分别为1.2%～7.3%。试验结果表明，方法的准确度和精密度可以满足试验要求[13]。

表3 3种化合物回收率和精密度（n=6）

2.4 样品的测定

采用建立的方法测定40批市售茶叶样品中3种农药，尚未有检出。

3 结论

通过优化不同的提取方式、净化剂用量建立基于分散相萃取法联合LC-MS/MS检测茶叶中灭草松及其代谢物的分析方法。该方法具有操作简便、快捷、定性定量准确度高等特点，可应用于茶叶中3种新增农药（灭草松及其代谢物6-羟基灭草松和8-羟基灭草松）的残留检测，为解决茶叶的农药残留检测技术提供技术指导。